Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 01/08/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-105288)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La dysplasie broncho-pulmonaire (DBP) est la principale complication liée à la grande prématurité. La DBP peut se compliquer d’une hypertension pulmonaire (HTP-DBP) responsable d’une mortalité importante dans les 2 ans suivant le diagnostic, par défaillance cardiaque droite. Par ailleurs, les altérations pathophysiologiques présentes pendant la période néonatale persistent dans le temps chez les grands prématurés survivants, augmentant leur risque de développer des maladies respiratoires et cardiovasculaires sévères à l’adolescence et à l’âge adulte. Les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HTP-DBP sont encore méconnus et il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement préventif ni curatif de cette maladie. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. Ainsi, dans ce projet, nous utiliserons des modèles animaux (rats et souris) d’HTP-DBP expérimentale induite par hyperoxie, classiquement décrits dans la littérature et utilisés au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Ces modèles animaux sont les modèles qui reproduisent le mieux la pathologie humaine. Dans ces modèles, nous étudierons de manière longitudinale, l’évolution des altérations pathophysiologiques de l’HTP-DBP à différents âges (jour (J)15, J60, J180 et J365 chez les animaux, ce qui correspond chez l’humain à la période de l’enfance (
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’HTP-DBP et leur évolution dans le temps. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs sera comparée ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un groupe sera exposé à l’air ambiant (normoxique – groupe contrôle) et un 2ème groupe sera maintenu en hyperoxie chronique dans les 24h suivant la naissance, pour une durée de 14 jours (J). Un échange des mères entre les groupes sera effectué toutes les 24h, afin d’éviter l’effet toxique lié à l’oxygène chez ces mères. La méthode et la fréquence d’injection pendant la mise en place des modèles pathologiques seront ajustées en fonction de la substance considérée. Le protocole préventif sera appliqué dès le début du protocole (au jour 2 de vie des ratons ou souriceaux) et le protocole curatif sera appliqué à la fin des 14 jours d’hyperoxie jusqu’à la fin du protocole J60 (adolescence, 12-18 ans), J180 (jeune adulte, 25-30 ans) et J365 (adulte, 40-50 ans) chez le rat et la souris. Après 14 jours, une partie des ratons/souriceaux sera anesthésiée afin de réaliser des échographies cardiaques (10 minutes/animal), des mesures de pressions cardiaques (10-15 minutes/animal) et des mesures de la fonction respiratoire par pléthysmographie invasive (5-10 minutes/animal) pour diagnostiquer la présence d’une HTP-DBP et en évaluer la sévérité. Tous les animaux auront ces différentes mesures avant l’extraction du bloc-cœur-poumon. Les animaux seront euthanasiés pour l’extraction du bloc cœur-poumon. Des prélèvements de sang pourront être effectués sur certains animaux juste après l’euthanasie et avant de récupérer le bloc cœur-poumon. L’échographie, les mesures hémodynamiques et les mesures de fonction respiratoire permettront également d’évaluer l’efficacité des traitements thérapeutiques. L’autre partie des animaux sera placée en normoxie seule, en présence d’une mère allaitante jusqu’au sevrage puis en condition d’hébergement classique jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours pour le rat et la souris. Durant cette période de « vieillissement », les animaux seront pesés 2 fois/semaine et tous les animaux auront une échocardiographie sous anesthésie générale aux différents temps d’évaluation, y compris ceux qui poursuivent le protocole de « vieillissement » à J60, 180 ou 365. Ainsi, les animaux explorés à J60, J180 et J365 auront au total, respectivement 2, 3 et 4 échographies cardiaques durant le protocole. A l’issue de chaque période de « vieillissement », les animaux seront anesthésiés afin de réaliser des échographies cardiaques, des mesures de pressions cardiaques, des mesures de la fonction respiratoire et des prélèvements de sang et extraction du bloc cœur-poumons.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’HTP-DBP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Nous avons une grande expérience du suivi notamment respiratoire des animaux sous des atmosphères en oxygène variées au laboratoire et nous serons particulièrement attentifs aux points limites qui constitueront un arrêt des protocoles. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP-DBP chez les animaux. Les points d’injection des substances et/ou solvants à tester peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés. Le risque de douleur est le principal effet indésirable des expérimentations in vivo. De ce fait, nous réaliserons systématiquement une analgésie-sédation. Avant de débuter les expérimentations in vivo, la surveillance de la profondeur de l’analgésie-sédation sera réalisée en s’assurant de l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte en réponse au pincement des orteils des membres postérieurs. Le rythme cardiaque et la fréquence respiratoire seront surveillés pour s’assurer également de la profondeur de l’anesthésie. Le changement de mère toutes les 24h peut être source de stress pour les petits.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’HTP-DBP mais des études pourront être réalisées sur des cellules de poumons humains fœtaux en culture, exposées ou non à l’hyperoxie. Ce remplacement du modèle animal par un modèle in vitro permettra d’élucider certains mécanismes intracellulaires sans utiliser d’animaux. Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in/ex vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. Par ailleurs, cette pathologie implique plusieurs organes et plusieurs types cellulaires pulmonaires qui interagissent entre eux et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes et cellules.
2. Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux : (1) une partie des utilisateurs utilisera le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche, (2) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (3) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines fœtales exposées à l’hyperoxie in vitro pour simuler l’HTP-DBP. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée en concertation avec tous les utilisateurs lors de nos réunions d’équipe hebdomadaires. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (randomisation, travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. Le nombre d’animaux sera également réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs avant la fin de la totalité des séries prévues.
3. Raffinement
Selon la condition, 12-13 ratons ou 10 souriceaux et 1 mère allaitante seront placés soit dans l’enceinte à hyperoxie soit dans une cage classique. L’enceinte à hyperoxie et la cage classique contiendront une couche de litière suffisante pour absorber l’humidité, des éléments de nidification (coton, papier kraft) et du matériel d’enrichissement (un tunnel rouge et buchettes de bois). L’accès à l’eau et la nourriture sera ad libitum. Les paramètres ambiants (hygrométrie, température) seront contrôlés quotidiennement et conserver sur un registre. Un cycle jour/nuit de 12h sera également appliqué. L’échange quotidien des mères sera réalisé par le même opérateur en utilisant le tunnel mis à disposition dans la cage ou l’enceinte. Les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement. L’enceinte d’hyperoxie sera ouverte tous les jours pour l’échange des mères. A cette occasion, les animaux seront observés et pesés. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà d’une période de 2 h post-administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre. Une grille de scoring pour le suivi des animaux sera mise en place pour chaque animal L’ensemble des expérimentations in vivo sera réalisé sous anesthésie générale. Pour les mesures hémodynamiques un tapis chauffant sera utilisé pour préserver la température corporelle constante durant toute la procédure. Le degré d’anesthésie sera vérifié par l’absence de réflexe palpébral et/ou de retrait de la patte au pincement. Des modifications des paramètres physiologiques et notamment la fréquence cardiaque indiquant une souffrance ou une détresse de l’animal conduirait à une procédure d’euthanasie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP-DBP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. L’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont quasiment absents chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. De plus, le rat et la souris sont particulièrement adaptés pour modéliser la DBP car au moment de la naissance leurs poumons sont au stade de développement pulmonaire qui correspond au stade de maturation des poumons de nouveau-nés grands prématurés humains et les expérimentations pourront être menées chez des rats/souriceaux nés à terme et ne nécessiteront pas d’induire une naissance prématurée de ces animaux. La première partie de l’étude vise à reproduire une pathologie concernant uniquement les nouveau-nés grands prématurés, les expérimentations concerneront des rats/souris nouveau-nés pendant leurs 14 premiers jours de vie. La deuxième partie du projet portant sur l’évolution longitudinale des anciens nouveau-nés grands prématurés ayant eu une dysplasie broncho-pulmonaire, les expérimentations porteront sur des ratons/souriceaux ayant été exposés pendant 14 jours à l’hyperoxie ou à la normoxie en période néonatale puis laissés en normoxie seule jusqu’à l’âge de 60, 180 ou 365 jours (adolescent, jeune adulte et adulte chez l’homme respectivement).