Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-107341)
210 souris femelles gestantes vont etre utilisees, toutes tuees a l’issue, dans des procedures classees legeres. Chacune recoit une injection de BrdU a un stade de gestation defini, puis est tuee par dislocation cervicale entre deux et quarante-huit heures plus tard, ses embryons etant extraits et decapites pour etudier le developpement des neurones. Le porteur qualifie le phenotype de ces souris de non dommageable et presente la seule injection comme indolore, la gravite tenant a la mise a mort des meres et des embryons. Il affirme qu’aucune etude in vitro n’est possible, le gene etudie n’etant exprime que dans le cerveau.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des neurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise non seulement à améliorer les connaissances au niveau fondamental sur le développement des neurones GABAergiques, mais également à mieux comprendre quel est le lien entre ces neurones et la motricité fine, dont l’altération conduit chez les patients ARX dup24 à des troubles du langage et de l’utilisation de la pince formée par le pouce et l’index. Quand et comment sont apparues ces compétences qui sont propres à l’homme, sont encore le sujet de débats mais ces questions devraient bénéficier de ce modèle d’étude unique qu’est la duplication de 24 pb d’ARX.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Des femelles gestantes hétéozygotes (XmX) pour la mutation ARX dup24 seront soumises à une injection au BrdU à un stade particulier de la gestation (entre E13.5 et E16.5, c’est-à-dire 13.5 à 16.5 jours après accouplement). Ces souris seront ensuite euthanasiées de 2 à 48 heures plus tard pour récupérer les embryons qui seront également euthanasiés. Un maximum de 210 femelles gestantes (30 femelles/stade de gestation, voir en annexe) devrait être utilisé pendant la durée du projet.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Il n’y en a pas car le phénotype de ces souris est non dommageable. La seule expérimentation qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les femelles gestantes ayant reçu une injection au BrdU seront sacrifiées 2 à 48 heures après l’injection par dislocation cervicale et tous les embryons seront rapidement extraits du placenta et décapités
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif de cette étude est la caractérisation de l’effet de la mutation dup24 du gène ARX dans le développement des interneurones GABA afin de mieux comprendre le lien entre ce type de neurones et la déficience intellectuelle et les troubles de motricité fine observés chez les patients. Ce type de projet ne peut pas être mené in vitro car il n’existe pas de type cellulaire neuronal exprimant ARX de manière endogène et ce gène n’est exprimé que dans le cerveau, ne permettant pas de prélèvements chez les patients.
2. Réduction
Concernant la réduction du nombre d’animaux utilisés dans cette étude, il sera adapté au plus juste afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Pour les injections de BrdU, nous prévoyons d’utiliser maximum 30 portées pour chacun des stades (en fonction du nombre de coupes nécessaires à tester en histologie et en fonction du nombre d’embryons par portée). Ces chiffres peuvent paraitre élevés mais nous n’avons pas toujours la certitude de pouvoir avoir les 4 génotypes au sein d’une même portée et pour ce type d’expérience, il est très difficile de comparer des individus issus de portées différentes. Pour l’instant, nous prévoyons de tester différents stades embryonnaires (voir document en annexe) car nous ne savons pas exactement à quel stade nous pouvons nous attendre à voir des différences de nombre de progéniteurs neuronaux. Cependant, le nombre d’animaux utilisés dans cette étude sera adapté au plus juste en fonction des résultats obtenus au cours des 5 ans afin de pouvoir garantir une interprétation scientifique et statistique des résultats tout en prenant en compte la variabilité individuelle. Le test de Student sera réalisé pour tester la significativité des résultats obtenus. Au total, nous prévoyons donc d’utiliser un maximum de 210 animaux sur la durée totale du projet (5 ans).
3. Raffinement
Les souris seront hébergées en cages 1284L réglementaires, souvent avec leurs frères ou sœurs, avec de la cellulose et équipées d’igloos pour l’enrichissement au milieu. Ces souris portant la mutation c.429_452dup24 dans le gène ARX ont été générées à l’Institut Clinique de la Souris (Illkirch) qui leur a fait passer un grand nombre de tests de comportement. Les résultats obtenus (et publiés : Dubos et al., Human Molecular genetics, 2018) montrent que ces souris sont en bonne santé et que la mutation ARXdup24 n’entraîne pas de phénotype dommageable. La seule procédure qui sera réalisée sur les animaux vivants est une procédure de classe légère, à savoir l’injection de BrdU en péritonéal qui, bien réalisée, n’est pas connue pour provoquer de stress ou de la souffrance chez l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous travaillons ici sur un modèle de souris transgénique (knock-in) pour lequel un fragment de l’exon 2 du gène de souris a été remplacé par un fragment du gène ARX humain contenant la mutation c.429_452dup24. La souris est un modèle approprié à l’étude des mécanismes moléculaires contrôlant le développement du cerveau car le développement de ce dernier est proche de celui de l’humain, en particulier aux stades embryonnaires étudiés. De plus, dans le cas de l’étude de maladies génétiques rares comme c’est le cas des pathologies associées aux mutations du gène ARX, ce modèle permet d’étudier plus en détail les mécanismes physiopathologiques liés à des mutations particulières grâce à l’étude des phénotypes observés chez l’animal. La majorité des animaux utilisés sera au stade embryonnaire car c’est la période à laquelle est surtout exprimé le gène ARX. Cela nécessitera de sacrifier des femelles gestantes afin de pouvoir récupérer les embryons.