Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-112854)
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent l’ablation des glandes lacrymales pour provoquer une sécheresse oculaire douloureuse, puis l’instillation d’une solution qui active les nocicepteurs et provoque une sensation de brûlure, avec des tests nommés de sensibilité cornéenne et d’imagerie de la cornée. Le porteur veut cartographier les circuits neuronaux de la douleur oculaire chronique et le rôle de l’inflammation. Il affirme qu’une approche sur animal entier reste incontournable car ces circuits impliquent tout l’encéphale.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux et les mécanismes qui en sont à l’origine sont encore mal connus. Ce projet, en utilisant un modèle murin de sécheresse oculaire qui mime les symptômes de la pathologie humaine, a pour but de cartographier précisément les circuits neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne. Le rôle de l’inflammation dans ces douleurs sera également évalué. Ce projet repose sur l’utilisation de souris sauvages afin de mettre en évidence les circuits cérébraux de la douleur oculaire et de souris transgéniques afin d’évaluer le rôle de l’inflammation dans ces douleurs.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les procédures expérimentales nécessitent de tester la sensibilité cornéenne au niveau basal, puis durant et après le développement de la douleur neuropathique cornéenne (CNP). Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, imagerie de la cornée, avant puis durant et après la mise en place de la CNP. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. – Test de sensibilité cornéenne : animal vigile, réalisé 3 fois (J0, J7 et J14), durée du test : 2 minutes/session – Imagerie de la cornée : animal anesthésié, réalisé à J0, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3minutes. – Imagerie IVCM : animal anesthésié, réalisé 1 fois (J0), durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une ’immobilisation complète de l’anima. Ces tests seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. La stimulation nociceptive cornéenne se fait par instillation d’une solution activant les nocicepteurs cornéens. L’instillation est réalisée une fois et dure 1 minute. La solution est lavée par dépôt d’une goutte de PBS. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui nécessite l’injection d’un analgésique puis d’une dose létale d’anesthésique.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. La douleur de la chirurgie d’exérèse sera contrôlée par une analgésie pré, per- et post-opératoire. Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soi un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme. Le test de sensibilité chimique sera réalisé, chez l’animal éveillé, par l’instillation d’une solution contenant un alcaloïde activant les neurones nocicepteurs entrainant ainsi une sensation de douleur (brûlure) et une inflammation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable.
2. Réduction
Nous utiliserons 280 animaux dans ce projet. Afin de respect la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
3. Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton, maison en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Le taux d’humidité des cages est contrôlé. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique. Les tests de la lampe à fente et l’imagerie confocale in-vivo qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Les animaux utilisés seront adultes (âgés de 2mois) à leur arrivée dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l’animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.