Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/05/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-140434)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles et de la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la fibrose pulmonaire. En effet, nos résultats obtenus in vitro montrent que les neutrophiles et NETs entrainent un environnement fibrotique. Ainsi, nous voulons maintenant confirmer nos résultats chez la souris en utilisant un modèle de fibrose pulmonaire induite par instillation intranasale de Bléomycine. En effet nous nous attendons à une diminution de la fibrose pulmonaire induite par Bléomycine après inhibition du recrutement des neutrophiles et NETs et de leurs sous-effecteurs (que nous avons identifié in vitro).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de fibrose pulmonaire. En effet, il n’y a aucun traitement vraiment efficace de nos jours pour diminuer la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà identifié la présence de NETs dans les poumons de souris atteinte de fibrose pulmonaire (induite par bléomycine) ainsi que dans les poumons de patients atteints de fibrose pulmonaire. Cette étude permettra de mettre en évidence les neutrophiles et les NETs comme cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer la fibrose pulmonaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Nous administrerons par instillation nasale de la bléomycine chez les souris C57BL/6 femelles placées sur un tapis chauffant sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une à deux minutes, et une fois les souris endormies, elles seront instillées nasalement avec de la bléomycine, tout en étant endormi). Les souris seront ensuite replacées dans leurs cages. L’administration des inhibiteurs/anticorps et de leur véhicule commencera 30 minutes avant l’administration de bleomycine, par injection intrapéritonéale et jusqu’à la fin de l’expérience. Chaque injection intrapéritonéale durera environ 30 secondes (le temps de contentioner la souris, de la position, de l’injecter et de la reposer dans sa cage).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs (vocalisation, agressivité). Les effets indésirables définis comme toutes atteintes à une ou plusieurs des 5 libertés fondamentales définissant le bien-être des animaux placés sous la responsabilité de l’être humain, sont les suivantes : – Une altération du déplacement. En effet, les animaux auront des problèmes de respiration causé par la fibrose pulmonaire, ce qui peux entrainer des problèmes de déplacements. – Des signes de douleurs. En effet, la fibrose pulmonaire peut être à l’origine de douleurs (causé par les problèmes de respiration), caractérisées par un comportement agressif de l’animal, des vocalisations, un manque de toilettage ou encore un dos vouté. – Des rougeurs peuvent apparaitre au niveau du site des IP.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort puis les poumons seront prélevées pour analyse ex vivo. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation 1) de fibrose pulmonaire, par marquage de la matrice extracellulaire en utilisant des techniques d’immunofluorescence ; 2) de la présence de neutrophiles/NETs/macrophages dans les poumons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Remplacer : Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’activation des macrophages et fibroblastes, qui sont les cellules à l’origine du dépôt accru de matrice extracellulaire responsable de la fibrose. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur l’activation des macrophages et des fibroblastes et ainsi la mise en place d’un environnement fibrotique. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules épithéliales pulmonaire et les cellules immunitaires, dont les neutrophiles), nous avons donc recours aux animaux.
2. Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur la fibrose pulmonaire (en quantifiant le collagène par immunofluorescence des poumons) avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettent d’estimer le nombre de sujet dans chaque groupe à 22. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De plus, les résultats déjà publiés avec ce modèle et l’utilisation de ce modèle lors de mon post-doctorat nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
3. Raffinement
Raffinement : Les signes cliniques attendus des animaux développant une fibrose pulmonaire sont des problèmes de respiration, de déplacements et des signes de douleurs. L’administration de bléomycine se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 1 minute, temps nécessaire à l’instillation intranasale de bléomycine). Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Cette fiche d’évaluation comprend des points limites qui sont précoces et adaptés. Notamment le poids des animaux et les sites d’injections seront surveillés et un suivi journalier est effectué (notamment lors des injections quotidiennes). De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement de la fibrose pulmonaire. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, le modèle de fibrose pulmonaire induit par instillation intranasale de bléomycine est couramment utilisé par la communauté scientifique. De plus, j’ai déjà utilisé ce modèle lors de mon post-docotrat pour étudier la cinétique de développement de la fibrose pulmonaire, et ce modèle m’a déjà permis d’identifier la présence de NETs dans les poumons des souris atteintes de fibrose pulmonaire induite par bléomycine. Les administrations de bléomycine seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représentent l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement de fibrose pulmonaire chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des poumons sur les souris se feront au maximum 28 jours après injection de bléomycine.