Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/08/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-142591)
80 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l’âge de deux jours, ils reçoivent une injection dans le cerveau de bleu de méthylène ou de solution saline sous anesthésie par hypothermie sur la glace, 60 étant tués juste après l’injection et 20 gardés jusqu’au sevrage. Le porteur indique que des pertes sont attendues du fait du jeune âge et du rejet des petits par la mère après l’injection. Cette étude ne teste aucun traitement, elle sert à caler le geste avant une future recherche de thérapie génique contre la sclérose latérale amyotrophique, et le porteur affirme que la souris reste un modèle « indispensable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L’incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d’environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre cette maladie, il n’existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L’une d’elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent des troubles moteurs associés à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de la stabilité à long terme de l’expression des gènes thérapeutiques dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l’homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l’expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place des injections dans le cerveau chez la souris à l’âge de deux jours, pour permettre la libération de matériaux génétiques dans l’ensemble du système nerveux central. Dans cette étude pilote nous utiliserons du bleu de méthylène pour confirmer nos sites d’injections. Après la mise au point de ces injections, des injections avec des AAV seront réalisées dans un modèle de souris SLA, afin de valider l’effet thérapeutique (cette étude fera l’objet d’une demande d’autorisation séparée).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet méthodologique permettra de mettre en place un protocole pour des injections intracérébrales chez la souris à un stade de développement précoce. Cette étude pilote précède une étude de thérapie génique reposant sur l’injection de virus AAV dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique. A long terme, ce projet permettra de mettre en place de nouveaux traitements contra cette maladie incurable.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec du bleu de méthylène ou une solution saline chez chaque souris à l’âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d’endormissement de l’animal et la préparation à l’injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront tous mis à mort en fin d’expérience pour prélever les cerveaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable.
2. Réduction
Cette étude pilote vise à acquérir le geste technique ainsi, pour la reproductibilité du geste technique et la justesse des coordonnées d’injections ainsi que l’étude de la survie des animaux, nous utiliserons 80 souriceaux : 60 sacrifiés immédiatement après les injections et 20 maintenus en vie jusqu’au sevrage. Il n’y aura pas d’analyse statistique.
3. Raffinement
Ainsi, afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d’enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l’arrêt de la chirurgie et de l’euthanasie de l’animal. Le réveil de l’animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Pour limiter toute souffrance chez l’animal nous suivrons les points limites suivants : -Si une souris présente des difficultés respiratoires, se réveille et/ou présente des signes de douleur durant l’injection ou au réveil, elle sera mise à mort. Les animaux maintenus en vie jusqu’au sevrage seront surveillés quotidiennement. -Si 24h après les injections une souris ne présente pas de « poche de lait » dans l’abdomen, c’est-à-dire qu’elle n’a pas pu s’alimenter avec le lait de sa mère, elle sera mise à mort -Si une souris ne retrouve pas une température corporelle normale c’est-à-dire présente une couleur bleue/violacée après les injections ou lors du retour à la mère, elle sera mise à mort. Durant le développement des souris nous contrôlerons la présence de signes cliniques d’affaiblissement (poil hirsute, prostration, difficultés à se déplacer, difficultés à s’alimenter…) Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s’agit d’une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l’âge de 7 jours lors d’interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l’environnement). L’hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d’un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, pour valider notre protocole et confirmer les sites d’injection.