Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 10/01/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-161884)
Comprendre comment se forment les cellules ciliées qui tapissent les cavités du cerveau, et l’origine de certaines maladies neurologiques : 2 037 souris vont y être utilisées. 1 987 d’entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 un niveau léger, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Des femelles gestantes sont gavées ou reçoivent un traceur sous la peau, leurs petits sont biopsiés à la queue le jour de la naissance, puis certains reçoivent une injection dans le cerveau suivie d’impulsions électriques, deux minutes par animal. Le porteur indique que le gavage peut léser l’œsophage et provoquer des mises bas prématurées ou difficiles, et que l’électroporation peut entraîner des microlésions du cerveau ou le rejet du souriceau par sa mère, tout en estimant à cinq ou dix animaux la taille optimale par stade d’analyse, pour un total de 2 037 souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les objectifs de notre projet de recherche sont d’une part de comprendre comment les cellules souches se développent le long des parois des ventricules du cerveau pour former différents types de cellules gliales. D’autre part, nous cherchons à comprendre l’origine de pathologies humaines telles que les ciliopathies et les maladies psychiatriques. Nous souhaitons donc utiliser des souris génétiquement modifiées afin de mimer ces pathologies humaines et ainsi identifier l’origine développementale de ces pathologies. A plus long terme, ce projet permettra de mieux identifier l’origine des dysfonctionnements dans certaines pathologies neurologiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’identifier les cascades moléculaires complètes du développement des cellule multiciliées du cerveau, les épendymaires qui tapissent les murs ventriculaires et les cellules du plexus choroïde. Nous pourrons ainsi mieux comprendre les étapes qui dysfonctionnent dans des conditions pathologiques telles que les tumeurs cérébrales et les maladies neurologiques (220 000 nouveaux cas chaque année en France). A plus long terme, nous pouvons envisager de nouveaux traitements thérapeutiques pour améliorer les conditions de vie des patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques: 1- prélèvement caudal unique sur des souris vigiles le jour de la naissance de quelques secondes pour génotypage, 2- injection sous cutanée unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles d’un traceur afin de réaliser un marquage des cellules d’intérêt chez les embryons puis euthanasie réglementaire des animaux sous analgésie et anesthésie en quelques minutes à différents stades, 3- gavage unique en quelques secondes de femelles gestantes et vigiles avec une solution permettant d’induire le modèle expérimental puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire en quelque secondes à différents stades, 4- injection unique au niveau cérébral sous analgésie et anesthésie, application d’impulsions électriques permettant l’introduction du traceur génétique chez les nouveaux-nés (environ 2 minutes par animal) puis euthanasie des animaux par une méthode réglementaire à différents stades.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les injections effectuées afin de procéder à un marquage cellulaire, une analgésie ou une anesthésie seront réalisées par voie sous-cutanée et pourront induire un stress pendant la contention ainsi qu’une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille. La molécule administrée par gavage aux femelles gestantes peut avoir un impact sur le déroulement de la gestation des femelles, provoquer des mises bas prématurées ou des difficultés de mise bas et avoir aussi un impact sur les embryons et nouveaux-nés. De plus, la méthode d’administration par gavage peut induire des lésions de l’œsophage ou de l’inflammation. L’électroporation à la naissance (injection au niveau du cerveau suivi de l’application de quelques impulsions électriques) peut entraîner des microlésions du cerveau et pourrait dans de rare cas entraîner un rejet par la mère ou un défaut de prise de poids. Concernant les anesthésies, les effets secondaires peuvent être les suivants : détresse respiratoire, réveil de l’animal et stress thermique. Dans le cadre de l’identification génétique des animaux, une biopsie caudale sera réalisée à la naissance. Les effets indésirables peuvent être le stress engendré par la contention/manipulation, la douleur légère et locale ainsi que la possibilité de saignement à la suite de la biopsie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l’ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucune technique ou outil biologique n’est actuellement disponible pour mimer correctement le développement des cellules multiciliées de cerveau de mammifères que nous étudions. En effet, nos résultats expérimentaux de cultures primaires démontrent que seuls certains aspects du développement épendymaire peuvent être étudiés in vitro. Certains mécanismes moléculaires semblent mal récapitulés dus, en partie, à la non-conservation de la structure tridimensionnelle de l’épithélium ventriculaire. De façon similaire, les résultats préliminaires obtenus sur des cultures d’organoïdes démontrent l’absence de cellules épendymaires dans ces modèles.
2. Réduction
Un total de 2037 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous utiliserons des mâles ou des femelles indifféremment pour réduire le nombre d’animaux et la taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. Nous estimons à 5 ou 10 animaux la taille optimale par stade d’analyse en fonction de la procédure.
3. Raffinement
Trois catégories de mesures de raffinement seront mises en œuvre et concerneront les aspects liés aux procédures, l’établissement de points limites ainsi que l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort des souris car les procédures que nous mettrons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Nous examinerons en parallèle le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez les souris consécutivement, ou non, à la réalisation d’un acte et non conduiront à l’arrêt de la procédure en cours. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la règlementation en vigueur à savoir : l’hébergement en surpression, les portoirs avec des cages ventilées individuellement, le nombre d’animaux par cage), eau et nourriture à volonté, change litière et biberon hebdomadaire, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu (papier kraft, coton et maison en carton). L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement des cellules multiciliées des mammifères. Nous utiliserons le modèle murin car la souris présente un développement proche de celui de l’homme. De plus la durée de gestation courte ainsi que la taille des portées permettent de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences et à partir de peu de parents. La disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, qui permettent d’induire ou inhiber l’expression de certains gènes d’intérêt, fait du modèle murin un modèle de choix pour répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons des femelles adultes matures sexuellement qui seront rendues gestantes par accouplement contrôlé afin de connaître précisément le stade de gestation afin d’induire les modèles expérimentaux. Par la suite les animaux seront étudiés au cours du développement cérébral (entre le jour de la naissance et 20 jours postnatal) parce que nous avons établi que les cellules d’intérêt sont spécifiées avant le stade embryonnaire et entièrement différenciées et matures au 15ème jour postnatal et constitue donc notre fourchette d’analyses dans ce projet.