Etude cinétique par voie orale et intra-veineuse en cross-over du devenir de l’Enniatine B chez le rat

Les Enniatines sont des mycotoxines produites par des souches de champignons Fusarium et appartiennent à la classe la plus courante de contaminants des céréales. L’Enniatine B est la molécule la plus prévalent parmi les 28 homologues identifiés dans cette famille de molécules et par conséquent nos concitoyens peuvent être exposés à de faible doses de manière chronique dans leur alimentation quotidienne. Malgré le nombre considérable de propriétés pharmacologiques et toxicologiques et la prévalence de cette mycotoxine dans les aliments à base de céréales il est éthiquement impossible d’étudier in vivo sa toxicologie et donc sa toxicocinétique (et notamment son devenir plasmatique) chez l’humain. Ainsi ce projet de recherche se propose d’utiliser des méthodes alternatives permettant de pallier ce manque de données toxicocinétiques chez l’humain. Ces alternatives reposent sur 3 étapes: a) la génération in vitro (à partir d’essais de laboratoires sur cellules) de données essentiellement de métabolisme qui constituent l’élément principal des différences inter-espèces dans la pharmacocinétique de la molécule étudiée puis b) par l’extrapolation vitro/vivo permettant de prendre en compte le changement d’échelle de la cellule à l’organe et enfin c) par une autre modélisation mathématique dite « pharmacocinétique basée sur la physiologie » permettant d’intégrer ces données cellulaires et tissulaires au fonctionnement de l’organisme (animal ou humain) entier. Les essais in vitro ont déjà été réalisés en incubant l’Enniatine B avec des cultures primaires d’hépatocytes humains et de rats. Il s’agit désormais de valider les extrapolations des cellules a l’organisme faites pour le rat en générant des données in vivo du devenir plasmatique et en les intégrant au modèle mathématique. Le rat a donc été choisi car la comparaison avec l’humain aura été préalablement réalisée à partir d’expérimentations in vitro réalisées sur des hépatocytes primaires de ces deux espèces.

D’une manière globale, ce projet vise à déterminer les paramètres métaboliques quantitatifs de l’enniatine B: clairances in vivo et in vitro. Ces nouvelles données permettront de développer un modèle mathématique humain de l’enniatine B basé sur l’extrapolation de l’in vitro vers l’in vivo et permettront d’estimer les concentrations plasmatiques en enniatine B en fonction des scénarios d’exposition. Parallèlement, nous déterminerons les réponses moléculaires induites par l’enniatine B après exposition aigüe et répétée sur des hépatocytes primaires de rat et d’humain. Ces réponses permettront de définir les concentrations effectrices de toxicité. Ces concentrations effectrices pourront être comparés aux concentrations plasmatiques déduites du modèle mathématique et ainsi déterminer un risque de toxicité de l’enniatine B pour l’Homme.

Le design de prélèvements se fera en deux séquences. Lors de la première séquence 4 rats seront choisis aléatoirement et recevront l’administration par voie iv (en moins de 10 secondes) et seront placés en cage à métabolisme afin de recueillir l’ensemble de leurs urines (recueil continu de l’ensemble des urines grâce à la cage à métabolisme). Deux rats se verront prélevés 0,1ml de sang 0min, 10min, 20min, 45min, 2h et 6h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 5, 15min, 30min, 1h, 4h et 8h après l’administration. Lors de cette même séquence les quatre autres rats recevront l’administration par voie orale (en moins de 10 secondes). Deux rats se verront prélevés 0,1mL de sang 0h, 1h, 4h, 7h, 9h et 11h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 1/4h, 2h, 6h, 8h, 10h et 12h après l’administration. L’ensemble des prélèvements de sang pour chaque rat sur cette première séquence est de 0,6 mL soit si l’on approxime le volume total individuel de sang à 30 mL, un prélèvement de 2% de ce total. Entre chaque administration, un temps suffisant pour permettre l’élimination de la molécule et la reconstitution d’une partie du sang des rats, sera respecté. Ce temps de récupération sera de 1 jour. Lors de la seconde séquence, le principe des séquences veut que les 4 premiers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie orale et à l’inverse les 4 derniers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie iv. Les prélèvements de sang réalisés sur chaque individu ont été limités à 6 prélèvements de chacun 100 μl par rat et par séquence. Ce qui fait pour chaque rat un prélèvement total de 4% du volume de sang individuel.

Pour réaliser la cinétique plasmatique, les rats seront achetés cathétérisés au fournisseur. A l’aide du cathéter, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l’expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (1 gavage par animal) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus d’une à deux minutes. De plus l’inconfort due au maintien en cage à métabolisme nécessaire au recueil de l’ensemble des urines, sera réduit à son strict minimum vis-à-vis de toute la durée d’hébergement (qui lui se fera en cage individuel), c’est-à-dire la phase de prélèvement de 8 heures après l’administration par voie intraveineuse (sur 4 rats lors de la première séquence et sur les 4 autres rats lors de la seconde séquence).

Chaque rat sera mis à mort à l’issue de la seconde séquence de prélèvement de la procédure dans des conditions éthiques, étant donné qu’ils ne seront ni réutilisés, ni replacés ni adoptés du fait de leur cathétérisation.

Sur la base de connaissances acquises sur l’Enniatine-B lors d’étude in vitro à partir de matériel biologique relevant des rats Sprague-Dawley, il convient de générer des données in vivo chez cette espèce afin de pouvoir les comparer aux données in vitro pour valider cette extrapolation et pouvoir la poursuivre avec le modèle mathématique. Les rats utilisés seront des rats Sprague-Dawley males d’environ 200-250 g (6-8 semaines). Ce stade a été choisi pour limiter la quantité d’Enniatine-B nécessaire tout en maximisant la possibilité d’obtenir des échantillons sériés de plasma. L’étendue indiquée ici dans leur stade de développement est due aux éventuelles contraintes du fournisseur en charge de la pose chirurgicale de cathéter.