Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-06-28 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-196344)
La queue plongée dans un bain-marie jusqu’à vingt secondes, les pattes posées sur une plaque chauffée jusqu’à trente secondes, la queue tirée par l’expérimentateur pour mesurer la force d’agrippement, la course sur tapis roulant puis sur cylindre rotatif : 720 souris passeront cette série de tests à six mois puis à un an. 1 246 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth vont être utilisées au total, 1 104 d’entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse histologique. 584 reçoivent une injection de virus adéno-associés entre le premier et le vingt et unième jour après la naissance, et des femelles sont isolées une semaine pour que leurs ultrasons soient enregistrés. Le porteur écrit que ces lignées ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité locomotrice, alors qu’il déclare lui-même 1 104 souris en gravité sévère.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le but de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles souris. La maladie se manifeste au début de l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par des repliements complexes des gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses et une vitesse de conduction nerveuse réduite. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d’utiliser ces souris et de moduler l’expression de deux gènes impliqués dans une voie de signalisation associée à la CMT pour tenter d’atténuer les symptômes associés aux anomalies de la myéline. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique ainsi que par l’injection de virus adéno-associés couramment utilisés dans la recherche médicale.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Ce projet va permettre de mieux comprendre quelle(s) voie(s) de signalisation sont impliquée(s) dans le dévelopement de la CMT. Une meilleure connaissance des processus moléculaires permettra de mieux comprendre la maladie et potentiellement de proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Pour réguler l’expression des gènes impliqués dans la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, une partie de nos animaux (584 sur 1246) sera injectée (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés entre le 1er et le 21ème jour après la naissance A soix mois et à un an, 720 souris (dont 360 injectés avec des virus adéno-associés) seront soumises à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire, la coordination motrice, la sensibilité, ainsi que la conduction nerveuse. Pour évaluer la force musculaire, les souris sont placées sur la grille d’un dynamomètre et la force d’agripement sera mesurée. Pour évaluer la coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant et sur un cylindre rotatif. Pour évaluer la sensibilité, les queues des souris seront mises dans un bain-marie et la latence d’enlèvement de la queue sera mesurée avec une durée limite du test de 20 secondes. Les animaux seront également placés sur une plaque chauffée et la latence de réaction sera notée avant de sortir l’animal avec un temps limite de 30 secondes.Pour évaluer la conduction nerveuse, la mesure de l’activité électrique musculaire des animaux se fera sous anesthésie générale. Amendement. Nous isolerons les femelles pendant 1 semaine puis nous les mettrons en contact avec des femelles wt plus jeunes pendant 10 minutes durant laquelles nous mesurerons les ultra-sons émis par les animaux isolés.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Dans cette étude, nous utiliserons trois lignées de souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Au vu des phénotypes observés chez les animaux modèles âgés (et donc montrant un pourcentage plus important des repliements de la myéline), nous n’anticipons pas que nos modulations d’expression des gènes de la voie de signalisation étudiée n’engendre de phénotypes plus grave qu’une diminution de la coordination motrice. Nous effectuerons néanmoins une étude des phénotypes dommageable sur ces animaux. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force musculaire, l’expérimentateur tire progressivement la queue de l’animal agrippé sur la grille du dynamomètre afin d’obtenir la force développée par la souris. Pour la coordination motrice, le fait de se déplacer sur un cylindre rotatif surelevé engenre du stress physique chez l’animal. Pour les tests de sensibilité, la chaleur ressentie par l’animal engendre un stress physique. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale. La chirurgie pour l’injection de virus adéno-associés au niveau du nerf sciatique sera réalisée sous une anesthésie générale, une antalgie en sous-cutané et en local sera réalisée avant et après la procédure. Amendement. Pour les tests de vocalisation, l’isolement des animaux pendant 1 semaine provoquera un stress de classe modérée mais l’isolement est le seul moyen de stimuler la vocalisation des femelles avant de faire le test.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements d’organes pour des études histologique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquée dans le développement de cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptomes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 8 souris par groupe pour l’étude de phénotypes dommageables et 15 souris par groupe pour l’étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats. Une première étude pilote sera réalisée à 6 mois avec un nombre réduit d’animaux. Nous effectuerons ensuite une étude de phénotypes dommageables et une étude histologique (8 animaux par groupe) à six mois. Nous réaliserons finalement une étude comportementale à 6 mois et 1 an tout en effectuant une étude histologique à 1 an (15 animaux par groupe).
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. La pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). En cas de douleur, et particulièrement après les injections intrathécales et intracérébroventriculaires, un analgésique pourra être administré et l’étude pourra être prématurément stoppée. La douleur sera évaluée à l’aide d’un score. L’étude sera stopée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure des nerfs est trop différente. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la structure des fibres nerveuses, de la coordination motrice, de la sensibilité et de la vitesse de conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. D’autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l’expression des gènes de la voie de signalisation étudiée dans notre équipe, nous injecterons des virus adéno-associés chez des animaux âgés entre 1 et 21 jours selon la voie d’administration choisie pour cibler les cellules de Schwann avant l’apparition des symptomes. Les défauts de myélinisation s’aggravent avec l’âge des animaux modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Nous voulons donc réaliser une première étude histologique à 6 mois, âge auquel 10% des fibres présentent des défauts de myéline chez les animaux modèles de la CMT. Nous réaliserons ensuite une étude comportementale suivie d’une étude histologique à 12 mois, âge auquel les animaux modèles de la CMT présentent des déficits de coordination motrice et de vitesse de conduction nerveuse.