Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-210519)
5 427 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. La plupart sont infectées par Mycobacterium tuberculosis au moyen d’instillations intranasales et reçoivent de multiples injections, une partie subissant une chirurgie de microscopie du poumon de deux à six heures menée sous anesthésie sans réveil. Le porteur indique une possible perte de poids et des altérations respiratoires, avec des expériences de survie prolongées au-delà de cent jours, et justifie la mise à mort par le classement du pathogène en risque biologique de niveau 3. Il affirme qu’aucun modèle cellulaire ne récapitule l’immunité anti-tuberculeuse et que la microscopie intravitale n’est applicable que chez la souris.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après COVID-19. Cela est partiellement dû à une forte résistance de la bactérie face aux traitements existants. C’est pourquoi dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques, il est aujourd’hui important de mieux comprendre les interactions entre le pathogène et l’hôte. Ces interactions incluent notamment les mécanismes par lesquels Mycobacterium tuberculosis parasite les macrophages qui sont à la fois les premières cellules immunitaires impliquées dans la lutte contre le pathogène, mais aussi le principal réservoir cellulaire permettant sa survie. Les macrophages CD169+ (Sialoadhésine, Siglec-1) forment une sous-population de macrophages dans la rate et les ganglions lymphatiques. Dans ces organes, ils sont capables de piéger divers antigènes et d’activer la réponse immunitaire adaptative. Les macrophages CD169+ sont également présents dans les poumons humains, ainsi que dans ceux de macaques et de souris. Cependant, le rôle de ces cellules pulmonaires lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis reste inexploré. Notre projet s’attache à caractériser les fonctions biologiques de CD169, que ce soit en tant que molécule ou en tant que marqueur de sous-populations de macrophages. Il existe dans le poumon deux populations de macrophages distinctes qui expriment CD169 : les macrophages alvéolaires (AM) et les macrophages associés aux nerfs (NAM). Il existe également une population de macrophages exprimant CD169 présente dans l’espace pleural. L’hypothèse centrale de notre projet est que le récepteur CD169 et/ou les macrophages CD169+ jouent un rôle critique dans la pathogenèse de la tuberculose. Notre stratégie expérimentale se divise en trois axes. Ce projet a pour objectifs : 1/ de caractériser la biologie des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et le rôle de la molécule CD169 à la surface de ces macrophages, 2/ identifier les voies métaboliques impliquées dans le fonctionnement des macrophages pulmonaires CD169+, 3/ visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ et leur capacité à interagir avec d’autres cellules dans leur environnement pulmonaire au cours de la tuberculose.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra de : (i) évaluer le fonctionnement biologique des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose et cartographier les principales voies métaboliques impliquées ; (ii) visualiser le comportement des macrophages pulmonaires CD169+ au cours de la tuberculose, (iii) caractériser les mécanismes de communication intercellulaire de ces cellules ; et (iv) identifier potentiellement une nouvelle cible cellulaire pour une thérapie ciblée sur l’hôte et à des fins de vaccination contre la tuberculose.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Dans cet APAFIS, – 45 souris seront mises à mort sans autre intervention – 500 souris recevront une à cinq injections intranasales réparties sur une semaine – 360 souris recevront une injection intranasale et une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant 7 à 10 jours – 1584 souris recevront une à cinq injections intranasales espacées de 1 à 5 jours et une injection rétro-orbitale – 192 souris recevront des injections intranasales quotidiennement pendant une semaine, puis tous les deux jours pendant une semaine, puis elles recevront une injection rétroorbitale – 120 souris recevront 4 injections intrapéritonales espacées de 2 à 5 jours et une injection intranasale – 800 souris recevront 2 à 4 injections intrapéritonales espacées de 1 à 5 jours, une injection intranasale et une injection rétro-orbitale – 576 souris recevront une injection intranasale, sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et une injection rétro-orbitale – 410 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h – 840 souris recevront une à deux injections intranasales (ou une intranasale + une intratrachéale), sept injections intrapéritonéales (1 jour sur 2) et subiront une chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon pendant 2 à 6h Les injections intranasales sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Les injection-rétro-orbitale sont effectuées sous anesthésie générale avec un analgésiant local. La chirurgie pour effectuer de la microscopie intravitale sur le poumon est effectuée sous anesthésie générale avec des antalgiques et des analgésiques. L’hydratation et la température de l’animal sont maintenus tout au long de la procédure. Les mises à mort seront réalisées par injection intrapéritonéale de pentobarbital, par disclocation cervicale sous anesthésie ou par asphyxie au CO2.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans cet APAFIS, les infections et les injections seront effectuées sous anesthésie afin d’améliorer le bien-être des animaux. La majorité des souris seront infectées par Mycobacterium tuberculosis. Pour les infections allant jusqu’à J42, aucun voire peu d’effets indésirables sont attendus sur les animaux (aucun signe indicateur d’un mal-être). Parfois, de légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés ainsi que des altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité). Ces effets n’apparaissent généralement qu’à partir de J35. Pour les expériences de survie, de plus fortes altérations de l’aspect, de la respiration et du comportement peuvent survenir au-delà de J100. Une perte de poids peut également être observée (généralement
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les souris de cet APAFIS seront mises à mort à la fin des procédures. Les souris des procédures 1-7 seront infectées par la bactérie Mycobacterium tuberculosis qui est responsable de la tuberculose. Ce pathogène étant classé risque biologique de niveau 3, il n’est pas envisageable de garder les souris en vie à la fin de ces procédures. Dans la procédure 8, nous utiliserons une technique de chirurgie afin d’imager les cellules immunitaires présentes dans les poumons. Les souris seront anesthésiées et analgésiées, mais la procédure est trop invasive pour pouvoir les réveiller sans douleur. Enfin, nous avons besoin de récupérer les ganglions lymphatiques des souris à l’issu de la procédure 9 afin de déterminer si les cellules T de l’immunité adaptative ont été activées. Le prélèvement de ces organes ne peut avoir lieu sur souris vivante ce qui nécessite leur mise à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la réponse immunitaire contre la tuberculose. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler que sur des modèles cellulaires qui ne récapitulent pas l’ensemble de l’immunité anti-tuberculeuse. En particulier, notre projet a pour but d’étudier une population cellulaire dans son contexte pulmonaire. Notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des ces cellules par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation de souris vivantes. Elles seront infectées puis mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire pulmonaire, ou nous réaliserons de la chirurgie afin d’observation les cellules immunitaires pulmonaires par microscopie intravitale.
2. Réduction
Notre équipe a une expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous avons notamment développé des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés (exemple : la préparation d’ARN, analyse de cytokines et charges bactériennes peuvent maintenant être réalisées sur le même échantillon).
3. Raffinement
Dans cet APAFIS, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. – Les instillations intranasales seront réalisées sous anesthésie générale fixe ou gazeuse. – Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie locale et gazeuse. – Pour la chirurgie (microscopie intravitale) nous utiliserons un analgésiant, un anesthésique local, un anesthésique fixe puis un anesthésique gazeux. La température corporelle et l’hydratation des animaux seront maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. De l’ocrygel, sera appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. – Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement jusqu’à J100 et biquotidiennement jusqu’à J120, le point le plus tardif. Les souris infectées par Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas pneumonie ou du lipopolysaccharide seront monitorées pendant 24h, durée maximale de l’expérience. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation (grille de score en pièce jointe de cet APAFIS et détaillée pour chaque procédure) et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation. Les animaux présentant des signes de souffrance sur cette base seront immédiatement mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Pour notre projet visant à explorer le rôle de CD169 dans l’infection par Mycobacterium tuberculosis, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l’excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, et ii) du fort degré de convergence des paramètres de l’immunité chez l’homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique et du comportement des macrophages CD169+ par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez Mus musculus. Nous considérons l’utilisation de modèles animaux plus complexes comme le cochon d’inde et le macaque comme des modèles réservés à des étapes plus avancées dans l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques. De tels projets, s’ils s’avèrent nécessaires, seront réalisés au travers de structures de service impliquant des consortiums de recherche et dépassant le cadre de ce projet. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à Mycobacterium tuberculosis.