Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 24/06/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-220492)
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par voie intraveineuse avec la levure Candida albicans pour reproduire une candidose invasive, suivies par température rectale pendant vingt et un jours, une partie recevant des antifongiques ou un produit d’immunothérapie. Le porteur indique qu’une proportion des souris ne survivra pas, mortes de l’infection ou tuées quand leur état se dégrade, et qu’une hypothermie déclenche la mise à mort. Il affirme qu’aucune méthode alternative ne modélise une infection fongique systémique et ses réponses immunitaires.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Chaque année, environ 250000 personnes dans le monde sont atteintes de candidémie (forme la plus courante des candidoses invasives) et 50000 en meurent en raison de sa détection tardive, du nombre limité d’antifongiques utilisables et de l’accroissement de l’apparition de souches résistantes. Candida albicans est une levure commensale de la peau et des muqueuses. Elle utilise donc notre organisme à son avantage sans que nous y trouvions un quelconque bénéfice ou inconvénient. Ce commensalisme repose sur un équilibre entre levure/microbiote et défenses immunitaires de l’hôte. En cas de rupture de l’équilibre, la levure colonise de manière excessive l’organisme hôte. Les causes sont: -utilisation à long terme/de façon répétée d’antibiotiques à large spectre -rupture de la barrière cutanée/gastro-intestinale (chimiothérapie/chrirurgie gastro-intestinale/perforation/utilisation de cathéter veineux). Ces ruptures provoquent une colonisation de l’intestin permettant le passage des levures dans le sang (candidémie) et la dissémination dans les organes (candidose disséminée). Candida fait parti des 10 causes les plus fréquentes de candidémies, et leur taux de mortalité est de 42% à 30 jours, résultant d’un diagnostic souvent tardif du pathogène impliqué. Le traitement est basé sur 3 classes d’antifongiques. La résistance naturelle des souches de Candida est à prendre en compte lors du traitement des candidoses invasives ainsi que le problème du développement des résistances acquises qui est de plus en plus présent depuis les 20 dernières années. Il est donc urgent de trouver des thérapies alternatives à ces antifongiques et/ou d’en limiter la consommation afin de réduire l’émergence de nouvelle résistace. Ce projet vise à mettre au point 2 modèles murins de candidose invasive traitée ou non aux antifongiques comme outils permettant de tester différents produits d’immunothérapie dans le but de lutter contre la résistance aux antimicrobiens classiques. Le premier modèle est utilisé dans l’optique de combiner un produit d’immunothérapie au traitement antifongique afin d’en réduire sa consommation/durée. Le second vise à tester un produit d’immunothérapie seul afin d’être une alternative au traitement antifongique. Dans notre programme, différents produits seront donc testés pour vérifier leur capacité à éliminer/contrôler l’infection, et comprendre les mécanismes mis en jeu suite à leur administration en présence et en absence d’antifongiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet rentre dans une thématique de recherche plus large dont l’objectif global est de développer de nouveaux traitements contre la candidose invasive basée sur la stimulation du système immunitaire des patients, afin de venir en support ou en remplacement des antifongiques, dont l’utilisation excessive permet l’émergence de souche résistante(s)/multi-résistante(s). Les bénéfices attendus à court terme doivent permettre : -de mettre en place les modèles animaux pertinents pour tester un premier produit d’immunothérapie, -d’améliorer la survie des animaux atteints de candidose invasive avec ou sans antifongiques, -l’avancement des connaissances scientifiques sur un produit d’immunothérapie injecté par voir intraveineuse dans un modèle de candidose invasive avec ou sans antifongiques, -d’utiliser un tel produit d’immunothérapie, comme traitement aussi bien dans les candidoses invasives sensibles ou comme alternative aux antifongiques. Les bénéfices attendus à long terme doivent permettre : -de tester différents produits d’immunothérapie dans l’indication de la candidose invasive sensible, -de présenter des données robustes aux autorités réglementaires afin de soutenir le développement clinique d’un ou plusieurs produits d’immunothérapie pour espérer obtenir ensuite une autorisation de mise sur le marché pour soigner les patients atteints de candidose invasive seul ou en association avec des antifongiques -de se substituer aux antifongiques ou d’en diminuer leur consommation dans les soins intensifs.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -infection à Candida albicans par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 100% des animaux -Administration des antifongiques par injection intrapéritonéale pour 50% des animaux (2 fois maximum/souris et 1 min/animaux) -Injection d’un tampon par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 8% des animaux -Injection d’un produit d’immunothérapie, parmi les 3 produits à visée thérapeutique à tester, par injection intraveineuse sous brève anesthésie générale gazeuse (1 fois/souris et 2 min/animaux) après anesthésie locale (15 secondes/souris) pour 49% des animaux) -Suivi quotidien des animaux: prise de température interne pa voie rectale (30 secondes/souris) pendant 21 jours maximum pour 100% des animaux -Prélèvement de sang sous anesthésie locale (30 secondes/souirs) pour 100% des animaux
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les souris vont être inoculées par voie intraveineuse par Candida albicans à différentes doses afin de mimer la pathologie humaine, après anesthésie locale et générale gazeuse. La candidose invasive étant une infection mortelle chez l’homme dans 42% des cas, Il est donc attendu qu’une proportion de nos animaux ne survive pas, soit directement de leur infection, soit par mise à mort en raison de leur état général dégradé. Il est probable que la proportion d’animaux ne survivant pas, soit plus importante dans la première procédure que dans les deux suivantes, le but de ces dernières étant de trouver un équilibre entre mortalité et survie afin de pouvoir répondre aux questions posées. On peut s’attendre à ce que l’état général des animaux se dégrade, avec par exemple une perte/baisse de leur mobilité, une perte de poids et à une élévation ou une diminution de la température interne chez ces animaux, suite au développement de la candidose invasive, pendant 2-3 jours. Une partie des animaux va recevoir un traitement antifongique par injection intrapéritonéale, engendrant une légère douleur au point d’injection au moment de celle-ci. Puis certains animaux recevront une injection d’un produit d’immunothérapie parmi les 3 produits à tester, par voie intraveineuse après anesthésie locale et générale gazeuse. L’injection de ces produits n’a causé aucun dommage chez la souris naïve, mais dans le contexte de candidose invasive traitée ou non aux antifongiques, une augmentation de la température corporelle interne est potentiellement envisageable dans les 24h suivant l’injection. Un prélèvement de sang sera réalisé après anesthésie locale au moment de leur mise à mort. La douleur relative au prélèvement devrait être réduite par l’anesthésie locale et ne pas durer plus de 5 minutes, entre le moment du prélèvement et celui de la mise à mort de l’animal. Il est peu probable mais néanmoins envisageable que l’on puisse observer une apparition de lésion ou une infection bactérienne suite à l’injection ou au prélèvement sanguin.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux inclus dans les procédures sont mis à mort car pour chaque procédure un certain nombre d’organes sont prélevés, ce qui nécessite la mort de l’animal, afin de caractériser ceux touchés par l’infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d’immunothérapie. Cela permettra de déterminer les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée plus précisément dans la suite du programme.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les objectifs de ce projet sont la mise en place deux modèles de candidose invasive traitée avec ou sans antifongiques afin d’évaluer la capacité de traitement d’immunothérapie à améliorer l’état général de ces animaux, dans le but à plus long terme d’en étudier les conséquences immunologiques sur un organisme vivant, entier. Afin de répondre à ces objectifs, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser une infection fongique systémique, ni les réponses immunitaires mises en jeu lors de ces infections avec ou sans traitement antifongiques et/ou d’immunothérapie.
2. Réduction
Tout au long du projet, nous essaierons de réduire le nombre d’animaux sans toutefois compromettre la fiabilité des résultats. Le nombre de souris par groupe a été déterminé à la suite d’une étude préliminaire, qui a permis d’estimer la variabilité du modèle et d’atteindre une différence statistique entre les 2 groupes quand le produit augmente significativement la survie de 30%. Le nombre de souris pour répondre à la question posée étant trop important pour être maniulé en une seule fois, un premier lot de 10 souris par groupes sera utilisé. Si ce nombre ne suffit pas pour répondre significativement à la question, un autre lot de 10 souris par groupe sera réalisé jusqu’à atteindre les 30 souris théoriquement suffisantes pour y répondre avec une différsence statistique entre les groupes. Toutefois, si un problème technique devait intervenir sur un ou plusieurs groupes des ces 3 séries et qui empêcherait d’obtenir une différence significative entre certains groupes (ce qui rendrait la conclusion incertaine), ces groupes seraient répétés en procédant de la même manière qu’au-dessus. De cette façon, dès que le nombre d’animaux est suffisant pour répondre à la question posée avec une différence significative entre les groupes, l’expérience s’arrête. Le nombre de souris restant, prévu pour répondre à la question mais n’étant pas encore commandé ne sera donc pas utilisé. De plus, si nous n’arrivons pas à trouver les conditions d’injections du produit d’immunothérapie pour qu’il augmente la survie des animaux de 20% minimum,le projet sera arrêté. Les résultats obtenus seront utiles pour la suite du programme. En effet, un certain nombre d’organes seront prélevés post mortem afin de caractériser ceux touchés par l’infection et ceux qui ont été impactés par le traitement d’immunothérapie et donc déterminer les organes dans lesquels la réponse immunitaire sera étudiée dans la suite du programme. Enfin, s’il est impossible d’obtenir les résultats souhaités dans l’un des deux modèles de candidose invasive, il sera alors abandonné dans les procédures restant à réaliser.
3. Raffinement
Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie générale gazeuse après application d’un anesthésique local. Les prélèvements sanguins se font sur animaux vigiles après application d’un anesthésique local quelques minutes avant. La mort des animaux intervient minimum 3 jours après l’infection par Candida albicans. Les animaux seront donc suivis une fois par jour pendant les 2 premiers jours post-infection. Pendant la durée présumée durant laquelle la mortalité est attendue, entre J3-8, les animaux seront suivis matin et soir. Enfin, une fois passé cette période critique et en fonction de l’état général des animaux observé, la fréquence de suivi sera adaptée jusqu’à la fin de la procédure. En période critique, J3-8, le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), leur poids, leur température prise par voie rectale, ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. En période non critique (J0-2 et J9-21), le suivi du matin, consistera en une surveillance de l’état général des animaux (poils, posture, mobilité…), ainsi que le site d’injection de Candida albicans et des produits d’immunothérapie. Le suivi du soir consistera en une évaluation visuelle de l’état des animaux. Tout animal dont le comportement est anormal, sera sorti de la cage et sera traité comme le matin en période critique, afin de déterminer si son état requiert ou non une mise à mort anticipée. Pour éviter toute douleur inutile aux animaux, du paracétamol sera donné dans l’eau de boisson à tous les animaux pendant une durée maximale de 6 jours de J2-8, période attendue de la mortalité des animaux. Ce traitement pourra être renouvelé si besoin après une pause thérapeutique de 3-4 jours. En cas de lésion, les yeux seront nettoyés au sérum physiologique. Si une infection bactérienne et/ou dégradation de l’oeil sont observées, l’animal sera mis à mort. En cas d’hypothermie d’un animal, il sera mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin est un modèle animal établi et reconnu pour réaliser de premières étudies de preuve de concept mettant en jeu un système immunitaire complet. En effet, le système immunitaire de la souris est bien décrit et les réactifs nécessaires sont largement disponibles. D’autre part, ayant initié une étude préliminaire dans cette espèce qui a donné des résultats encourageants, il nous semble pertinent de poursuivre les investigations dans le même modèle. Les produits d’immunothérapies qui sont développés dans ce programme ont pour visée d’être utilisés chez l’homme. Ils cibleront des patients adultes. Nous cherchons à faire une preuve de concept de l’efficacité des produits d’immunothérapie dans des animaux ayant un système immunitaire fonctionnel. Pour cela, nous utiliserons des souris d’au moins sept semaines pour ces études précliniques.