Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 13/07/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-229581)
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris double knock-out sont suivies de 3 à 10 mois par des tests visuels dont un test optocinétique et un électrorétinogramme sous anesthésie, pour étudier une dégénérescence de la rétine. Le porteur indique qu’il retire délibérément tout enrichissement de la cage pendant les mois d’expérimentation, l’enrichissement modifiant la progression de la maladie. Il affirme que la fonction de la rétine ne peut s’étudier sur des cellules en culture et renvoie la thérapie envisagée à une preuve de concept.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet est de suivre la progression du déficit de vision des souris avec des gènes doubles knock-out, y compris la fonction des photorécepteurs cône et bâtonnet, l’acuité visuelle, la structure de la rétine, etc. Les deux gènes sont paralogue et les deux knock-out existent pour chaque gène. Le phénotype de chacune de ces souris a été étudié précédemment. Elles présentent toutes deux un déficit de vision important avec une fréquence différente en terme de dégénérescence des cônes. Ceci suggère que les deux gènes ont une fonction distincte dans la protection des cônes. Nous nous attendons à un déficit de vision plus sévère chez les souris dont les deux gènes sont inactives, permettant ainsi d explorer la future stratégie de traitement de type combinatoire.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’analyse des phénotypes chez les souris à double gène nous aidera à mieux comprendre l’interaction et leur effets compares à un seul gène. Nous possédons des arguments pour anticiper que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergétique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux produits du gène comme alternative à la stratégie thérapeutique indépendante de la mutation causale de la rétinopathie pigmentaire.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les différents tests seront réalisés sur les mêmes animaux des quatre génotypes à 3, 6 et 10 mois. Test comportemental optocinétique (OKT, 5 min), fond d’œil grâce à une caméra de fond d’œil numérique (MICRON III, 5 min sous par gaz anesthésie), imagerie de la rétine par tomographie par cohérence optique (OCT, 5 min sous par gaz anesthésie), et électrorétinogramme (ERG, 30 min sous anesthésie par injection intrapéritonéale).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous anticipons des effets indésirables modérés dues aux paramètre suivants : absence d’enrichissement, chambre noir, test de comportement/stress, injection IP/contention/piqûre, anesthésie. Nous prévoyons un stress pour l’hébergement sans enrichissement, chambre noire ou encore comportement ; inflammation locale au site d’injection pour les IP ou encore risque anesthésique pour les actes sous anesthésie générale. Chambre noir est requis pour la mesure d’ERG scotopique. Pour l’absence d’enrichissement, tout est mis à contribution pour pouvoir reproduire le déficit visuel des souris contrôles précédemment étudiées en l’absence d’enrichissement La littérature montre que l’enrichissement affecte la progression de la dégénérescence de la rétine chez les souris rd10. Quinze jours précédant la première expérience, nous acclimatons les animaux en enlevant l’enrichissement. Nous supprimerons donc l’enrichissement uniquement durant la période d’expérimentation, commençant du 3eme mois au 10eme mois.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris seront testées à 3, 6 et 10 mois. La durée est fixée à 10 mois par des expériences publiées précédemment, mais la mesure des paramètres à 6 mois pourrait nous amener à repousser ce durée à 12 mois, ou même plus. Après la dernière mesure, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire. Les rétines des deux yeux de ces souris seront prélevées pour mesurer la densité des cônes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’étude de la fonctionnalité de la rétine d’un modèle murin au cours du vieillissement ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Les photorécepteurs des organoïdes rétiniens obtenus par reprogrammation de cellules souches n’ont aucune fonction électrophysiologiques.
2. Réduction
Pour appréhender une aggravation statistiquement significative du phénotype visuel des souris analysées, il faut nécessairement répéter les mesures sur ces dernières car un design expérimental adéquat est requis. Il est aussi nécessaire de valider le déficit visuel pour ces dernières souris en le rapportant à la vision de la souris contrôle. Les quatre groupes sont donc requis scientifiquement. Le nombre de souris par groupe (n = 12), soit au total 48 souris, avec trois répétitions de cette expérience soit n=144. Ce nombre est estimé d’après des travaux antérieurs et par l’estimation du pouvoir statistique à atteindre pour obtenir une différence statistiquement et biologiquement significative. L’information extraite de chaque animal est poussée à son maximum en analysant les deux yeux de chaque souris. Chacun des quatre groupes de souris sera analysé à 3, 6 en 10 mois pour la fonction et la survie des bâtonnets et l’acuité visuelle des cônes leur fonction
3. Raffinement
De façon générale, les animaux seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou l’expérimentateur. Nous les considérons comme en bonne santé si leur pelage est brillant et que leur comportement est normal. S’il y a des signes de malaise, comme un comportement anormal, une perte de poids, une déshydratation, une prostration, un prolapsus rectal, etc. L’expérience sera arrêtée et le personnel qualifié de l’animalerie estimera le niveau de malaise, puis décidera d’observer, de traiter ou de les euthanasier. Toutes les expériences de chaque étape sont non invasives et l’analgésie et l’anesthésie seront utilisées pour réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Si les risques d’anesthésie sont observés, tels que la dépression respiratoire, l’accident vasculaire cérébral, etc., l’animal sera alors, retiré du groupe et euthanasié. Les tests de comportement sont réalisés par une même personne permettant ainsi de réduire le stress des animaux et d’éviter des variations intra-individuelles.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le phénotype visuel des souris avec inactivation d’un seul des deux gènes a été étudié précédemment. La souris est aussi une modèle pertinent d’étude des dégénérescences rétiniennes héréditaires. Les quatre cohortes seront suivies entre 3 et 10 mois, soit durant la période de perte de vision dans nos études publiées. Ces animaux seront placés dans une pièce dont l’intensité de la lumière et le cycle jour/nuit est contrôlé dès leur sevrage.