Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-235453)
Nage en tire-bouchon, convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème, hémorragie : ces signes déclenchent la mise à mort du poisson concerné. 8 640 poissons zèbres vont être utilisés, 4 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 880 un niveau modéré et 1 440 un niveau léger, tous tués à l’issue. Des œufs fraîchement fécondés sont exposés à cinq concentrations d’un produit chimique pendant environ trente jours après l’éclosion, la gamme étant calée pour que la plus faible concentration produise environ 10 % d’effet et la plus forte environ 90 %. Le test répond à l’obligation réglementaire REACH pesant sur des monomères que l’entreprise produit et qu’elle ne pourrait plus vendre en Europe sans lui.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le test OCDE 210 est destiné à déterminer les effets létaux et sub-léthaux des produits chimiques sur les stades de développement de l’espèce étudiée (ici le poisson zèbre) et consiste à exposer des poissons aux premiers stades de leur vie à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 210 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. En absence de réponse à cette exigence, ces substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Le test consiste à exposer des oeufs fraichement fécondés à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau, pendant environ 30 jours après l’éclosion. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés : – Éclosion et survie : dénombrement quotidien des éclosions et des survivants. Les oeufs moisis, embryons et larves morts seront retirés dès qu’ils sont repérés. – Apparence anormale : dénombrement (à minima 3 fois par semaine) des larves et juvéniles présentant une anomalie corporelle. En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. – Comportement anormal : hyperventilation, nage mal coordonnée, immobilité ou comportement alimentaire atypiques seront notées à minima 3 fois par semaine. – Poids & longueur totale : après euthanasie des poissons ayant survécu jusqu’à la fin de la période d’essai.- Paramètres physico-chimiques pH, oxygène dissous et température : mesure quotidienne. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d’essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d’invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux utilisés ne peut pas être réutilisés et doit être euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce test est une exigence réglementaire imposé par les autorités compétentes. Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 210 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées. De même, il n’existe pas de modélisation validée pour remplacer l’utilisation d’animaux.
2. Réduction
Pour chaque test, le nombre d’animaux utilisé est défini par le protocole d’essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pé-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, , nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment) mais également sur des poissons adultes de la même espèce. Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligé de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
3. Raffinement
Les organismes géniteurs sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 210 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (sans visuel de gravier) et maintenus dans les mêmes conditions environnementales que les géniteurs, de sorte que seule la concentration de la substance testée peut avoir un impact. Les comportements et anomalies suivants ont été définis comme des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité) : nage « en tire-bouchon », convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème et hémorragie. Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (rotifère et artémies) est privilégiée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Cette espèce est l’une de celles recommandées par la ligne directrice. Elle est employée par le laboratoire depuis plus de 20 ans pour d’autres projets (dont le test de toxicité aiguë sur adultes). La ligne directrice impose d’exposer les organsimes au produit chimique depuis le stade oeuf fécondé jusqu’au stade juvénile (soit environ 30 jours après l’éclosion).