Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/07/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-244990)
Une nécrose de la peau entre trois et vingt-quatre heures, puis une ataxie et des vocalises à la manipulation : ces signes déclencheraient le point limite et la mise à mort chez des souris de dix-huit jours, non sevrées. 30 d’entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 21 et léger pour 9, toutes tuées à l’issue, le sevrage tombant le lendemain de la fin de l’essai. Chacune reçoit quatre injections sous anesthésie, séparée de la femelle adulte qui l’allaite et qui est elle aussi anesthésiée. L’essai vérifie l’inactivation d’une toxine dans trois lots d’un vaccin vétérinaire, une exigence de la Pharmacopée européenne pour obtenir l’autorisation de mise sur le marché, que le porteur annonce ne pas reconduire en routine ensuite.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet est le contrôle de l’inactivation d’un agent toxique dans le cadre du développement d’un produit immunologique à usage vétérinaire destiné à une espèce de mammifère domestique. Aucun modèle in vitro ne peut permettre de garantir l’inactivation de la toxine contenue dans notre produit. En effet, d’autres composés présents sont susceptibles de provoquer les effets décrits in vitro ce qui rend aspécifique un tel modèle. L’utilisation d’un modèle in vivo réglementaire décrit dans la Pharmacopée Européenne est demandé pour l’enregistrement du futur produit. Ces essais sont nécessaires en plus des contrôles in vitro réalisés sur le vaccin. Le test in vivo ne sera pas utilisé en routine mais sur des lots réglementaires représentatifs du procédé de fabrication reproductible et robuste, avec une étape de détoxification conforme (risques d’activité toxique presque nuls). Le dit agent toxique provoque des signes cliniques identifiables et spécifiques dans un temps court après administration à des souris jeunes. Nous vérifierons l’absence de signes cliniques dans trois lots de vaccins représentatifs du procédé final de fabrication afin de garantir aux autorités l’inactivation de la toxine dans la demande d’autorisation de mise sur le marché.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet contribue à la mise à disposition de produits immunologiques pour une maladie respiratoire qui touche l’espèce de destination, auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les requis pour la mise sur le marché de ces produits. La réalisation de ces essais permettra de garantir que les vaccins sont fabriqués avec un procédé robuste et qu’il ne sera pas nécessaire de faire le test d’inactivation de la toxine in vivo en routine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à une vaccination en 4 injections pour respecter la dose vaccinale à tester et le volume maximal injectable de 50µL. Le groupe contrôle négatif recevra le tampon de formulation du vaccin (sans principe actif) à l’identique. Chaque animal recevra donc 4 injections de 50µL une fois le jour de l’administration. Durée d’une injection sous cutanée/intradermique par animal: environ 1 minute (y compris le positionnement de l’aiguille et de l’animal)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Stress lors de la contention puisque les animaux sont jeunes, non sevrés, et habitués à rester auprès de la femelle adulte. La période de sommeil induite par l’anesthésie peut représenter un risque de difficultés respiratoires. Inconfort au réveil de l’anesthésie possible avec recouvrement de motricité retardé. L’apparition d’une nécrose dermique sur le site de l’administration représenterait le signe clinique d’une toxicité évoluant entre 3h et 24h. Les animaux souffriraient à 24h d’ataxie, des vocalises à la manipulation démontreraient une douleur. Dès l’apparition de signes cliniques le point limite spécifique sera mis en application de façon à ne pas laisser les symptômes se développer.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront euthanasiés: les souris non sevrées arrivent au sevrage à 21 jours soit un jour après la fin de la procédure, ils ne seront pas réutilisés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro qui permettrait de contrôler la détoxification de la toxine bactérienne. Selon des études in vitro, la toxine dermonécrotique pure provoque des modifications cytoplasmiques des cellules cibles en culture (Modèle in vitro décrit par Horiguchi et al,1995, 1997, 2002, 2010). Les techniques de microscopie utilisées sont représentatives d’une partie de la population cellulaire mais ne montrent pas la totalité des cellules soumises à l’action de la toxine. Dans notre produit, d’autres protéines peuvent avoir un effet sur l’architecture cellulaire. Ceci rend non spécifique une étude in vitro. La toxine dermonécrotique en faible quantité est toxique in vivo et est le seul agent potentiellement présent dans notre produit à engendrer des signes cliniques identifiables et spécifiques. Pour garantir réglementairement son inactivation dans notre vaccin vétérinaire nous utiliserons un modèle in vivo décrit dans la littérature (Weiss and al, 1994, 1998) et la Pharmacopée Européenne humaine.
2. Réduction
Le nombre d’animaux envisagés dans cette procédure à été défini à son minimum tel que décrit dans le texte de la Pharmacopée Européenne soit 3 animaux par groupe correspondant à un produit testé. Seuls les trois lots réglementaires utilisés pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché seront vérifiés, ce test ne sera pas utilisé en routine par la suite pour contrôler de futurs lots. Aucun groupe positif ne sera utilisé puisque 100 % des animaux réagissent spécifiquement en présence de toxine active.
3. Raffinement
Les mesures de raffinement utilisées sont : Conditions d’hébergement : les souris non sevrées seront hébergées dans la même cage que la femelle adulte, sauf pendant l’anesthésie, de manière à réduire leur stress. Une période d’acclimatation de 5 jours leur permettra de s’adapter à leur nouvel environnement, elles seront observées une fois par jour puis surveillées pendant l’expérimentation. Le matériel de nidification non souillé (feuilles de cellulose) présent dans les boîtes de transport sera transféré dans les cages afin de conserver une continuité olfactive (diminution du stress dû au changement d’environnement) et contribuer à la thermorégulation nécessaire aux souris non sevrées. Utilisation d’ un analgésique/anesthésique pour l’administration. Une surveillance mise en place jusqu’au réveil complet de l’animal et remise dans leur environnement. Les animaux seront réchauffés pendant la phase d’anesthésie par des tapis chauffants. Les femelles adultes seront anesthésiées pendant la réalisation de la procédure pour diminuer leur stress dû à la séparation de la portée. Observation quotidienne des animaux et examen/suivi clinique effectué aussi souvent que cela sera jugé nécessaire avec une fréquence qui pourra être augmentée en cas de besoin (en particulier si apparition de signes cliniques) Mise en place de points limites adaptés et spécifiques prédictifs dès 6 heures.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Test décrit dans la pharmacopée européenne sur souris non sevrées. Jeunes non sevrés (avant 21 jours) comme demandé par le texte de la Pharmacopée Européenne. Les animaux auront 18 jours au début de l’essai. Ils seront accompagnés d’une femelle adulte (utilisation de portée reconstituée). .