Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/07/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-302171)
Porteuses de mutations qui provoquent la maladie de Charcot, deux lignées de souris sont élevées pour fournir des lots à deux autres projets déjà autorisés. 375 souris à phénotype dommageable vont être utilisées sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, réduites pour l’essentiel à une biopsie de queue pour génotypage. Le porteur décrit la maladie comme paralysante, incurable et fatale, et indique que les animaux partent vers le site utilisateur à 70 ou 90 jours, avant les premiers signes moteurs, le stade terminal survenant à 170 jours pour la première lignée. Les souris qui n’ont pas le génotype attendu seront tuées, tout en pouvant servir d’animaux de compagnie aux autres pour éviter les cages solitaires.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière, responsables de la contraction des muscles striés. Environ 7000 patients en France sont touchés par la maladie de Charcot. La maladie commence généralement entre 50 et 70 ans avec une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire entrainant le décès dans les 2 à 3 ans suivant l’apparition des symptômes. Les modèles de souris de la maladie de Charcot permettent d’explorer des pistes thérapeutiques. Notre objectif est d’élever deux lignées de souris génétiquement modifiées présentant une diminution de leur capacités motrices. Les animaux sont produits dans le but de répondre à des objectifs scientifiques centrés sur deux modèles d’étude complémentaires de la maladie de Charcot. La production des animaux a pour objectif de constituer des lots expérimentaux pour deux projets déjà validés par le ministère de l’enseignement, de la recherche et de l’innovation. Cette présente demande d’autorisation de projet élevage permet de faire suite à la précédente et nous permettra d’assurer une continuité d’élevage. Les lots expérimentaux sont produits pour répondre à deux études thérapeutiques des deux projets connexes. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Nous avons fixé une durée du projet de 3 années pour correspondre aux projets connexes. Ces souris porteuses de mutation causant la maladie de Charcot, issues de cet élevage, sont transférées à l’établissement utilisateur avant l’apparition des symptômes, puis sont incluses dans le cadre des projets expérimentaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’élevage de deux modèles génétiques différents de la maladie permettra à terme d’évaluer deux approches thérapeutiques ciblant deux mécanismes distincts lorsque les souris seront utilisées en étude dans le cadre d’un autre projet. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet. L’élevage sur un site de deux lignées de souris porteuses d’une mutation causant la maladie de Charcot pour générer des lots expérimentaux qui sont étudiés sur un autre site utilisateur permet d’optimiser les espaces des sites utilisateurs. Le maintien de ces deux lignées sur deux sites permet également de réduire tout risque de perte d’une lignée et donc éviter de devoir générer des animaux en plus pour reconstituer une colonie. Les souris porteuses de la mutation (environ 50% de chaque descendance) sont transférées à un âge où aucun symptôme ne se déclare. La gestion du phénotype dommageable sur le second site se fait donc avec un personnel et un cadre spécifique au suivi de ce phénotype.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux des deux lignées décrites seront transférés sur le deuxième site d’expérimentation avant l’apparition du phénotype dommageable. Cependant un suivi quotidien par équipe de zootechnie permet de rendre compte de tout signe lié à la pathologie qui pourrait se manifester de manière inhabituelle : tels que la boiterie d’un membre postérieur chez un premier modèle de la maladie de Charcot ou les tremblements d’un membre postérieur chez le deuxième modèle de la maladie. En examinant rétrospectivement les autorisations précédentes aucun problème lié à la pathologie n’a été signalé dans le délai de transfert que nous proposons. La biopsie pour le génotypage ne prend que quelques secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable et fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien phénotypés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation des 3Rs. Le transfert des animaux du site d’élevage se fait à un stade qui exclut toute déclaration de premiers signes moteurs chez les deux lignées. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées est la diminution sélective des capacités motrices. Ces modèles présentent donc une atteinte motrice variable. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les individus sont produits uniquement à des fins d’élevage afin de générer des cohortes qui seront transférées dans d’une utilisation continue sur un autre site. Les animaux qui ne sont pas du bon génotype ou encore des animaux qui ont atteint un point limite seront euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre les neurones moteurs touchés dans la maladie et d’autres types cellulaires qui peuvent être très distants. Une telle interaction se met en place durant des mois et implique de nombreux autres types cellulaires autres que ceux ciblés ici. Notre premier objectif est de développer une approche thérapeutique utilisant des anticorps (immunothérapie) ciblant cette population de globules blancs. L’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle intégratif physiologique complet que seul l’animal offre. La barrière hémato-encéphalique et les méninges, qui sont les lieux où s’effectuent des échanges entre les cellules du système immunitaire et le système nerveux, illustrent la complexité de cette physiologie que l’on ne peut récapituler pleinement in vitro. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique vers la clinique. Notre second objectif est d’explorer une approche thérapeutique ciblant certaines populations de cellules du cervelet. Ces réseaux neuronaux très distants entre la moelle épinière et le cervelet ne peuvent pas être mimés in vitro. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent la diversité des interactions dynamiques et plastiques entre ces différentes populations de cellules. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer le potentiel thérapeutique des interactions aussi distantes qui peuvent exister dans cette pathologie. La validation d’une approche thérapeutique ciblant des interactions aussi distantes nécessite des modèles animaux. Cependant, afin d’explorer la pertinence des cibles thérapeutiques, nous développons des systèmes de co-cultures in vitro entre les cellules immunitaires et les neurones moteurs purifiés ainsi que des cultures organotypiques du cervelet.
2. Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 3 années, un nombre total de 375 souris avec phénotype dommageable. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement. Afin de minimiser le nombre d’animaux, les animaux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. La stratégie d’élevage que nous avons permet de produire le juste nombre d’animaux qui répond aux besoins de réduction précédemment validées dans les saisines connexes à cette demande. Nous avons suffisamment de recul sur la gestion des animaux pour assurer une production de lots expérimentaux définis sur le site d’élevage. Nous utilisons également pour nos lots expérimentaux des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.
3. Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’élevage est éviter que le phénotype dommageable survienne lors de l’élevage. Les animaux sont transférés bien avant la possible apparition de premiers signes moteurs. De façon rétrospectives avec nos précédents élevages aucun phénotype dommageable n’a pu être signalé en suivant l’âge limite pour lequel les animaux sont systématiquement transférés sur le second site utilisateur. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, PVC et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur, d’infection et de déambulation anormale compte tenu de l’âge est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. L’utilisation de mâles pour la reproduction permet d’avoir des portées plus robustes, plus nombreuses et de réduire de potentielles faiblesses car les femelles transgéniques sont connues commle étant de mauvaises reproductrices. Les animaux qui n’ont pas le génotype attendu pourront toujours servir d’animaux compagnons pour éviter tout animal isolé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats : début précoce ou tardif, progression lente ou rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. Nous évaluons deux protocoles thérapeutiques ciblant deux cibles cellulaires distinctes. Le protocole d’immunothérapie et de thérapie génique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie thérapeutique. La complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et des réseaux neuronaux distants et requiert un modèle mammifère à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Les modèles de souris de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits dans la littérature. Les souris sont élevées sur le premier site puis transférées avant l’apparition des symptômes sur un deuxième site où elles seront prises en charge pour l’expérimentation. Pour le premier modèle le début de la maladie se situe à 110 j et le stade terminal à 170 j. Les souris sont transférées à l’âge de 70 j. Pour le deuxième modèle, un défaut de réponse à une sollicitation motrice est détectable à 60 j, mais à cet âge les souris ne présentent pas de défauts moteurs spontanés et prennent plus de poids que les souris contrôles (+15%). A partir de 290 j, stade où des tremblements des pattes postérieures sont présents, c’est le stade symptomatique. La survie des souris n’est pas altérée. Ces souris sont transférées du site d’élevage à l’âge de 90 j vers le site d’expérimentation dans le cadre de l’utilisation continue.