Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 09/06/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-307873)
396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de cellules cancéreuses pour développer une carcinose péritonéale, puis un traitement par injection ou par aérosol pressurisé sous anesthésie, avant une mise à mort par ponction cardiaque. Le porteur affirme que les animaux ne souffrent pas de la maladie et signale un risque de mortalité lié à la laparotomie du groupe traité par PIPAC. Il conclut que les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La carcinose péritonéale est associée à un mauvais pronostic avec une survie médiane sans traitement de 5 mois. Le traitement à visée curative de la carcinose péritonéale repose sur la chirurgie de réduction tumorale qui a pour but de retirer toute la maladie macroscopique suivie de la chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale CHIP (c’est-à-dire le traitement d’une chimiothérapie chauffée à 43°C directement dans l’abdomen qui a pour but d’agir sur les nodules microscopiques). Ce traitement est très efficace, le taux de survie à 5 ans est alors de 45- 51%, avec une médiane de survie de 41 mois. Cependant, ce protocole comporte un risque important de mortalité et de morbidité. C’est pour cela que notre unité a choisi de s’intéresser à une alternative à ce traitement. Nous nous sommes intéressés aux Vésicules extracellulaires (VEs) dérivées des cellules souches car il a été montré que les VEs chargées en mTHPC (molécule utilisée en thérapie photodynamique pour l’activation des macrophages; dans notre projet nous utiliserons de la chimiothérapie dans les VEs) avaient une plus grande affinité pour les nodules de carcinose alors que la forme libre de mTHPC ciblait tous les tissus. Le mTHPC (meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin) a été utilisé dans une étude précédente pour montrer l’efficacité des VEs. De plus, nous nous sommes aussi intéressés à la grande avancée depuis 15ans dans le traitement des carcinoses péritonéales : la technique PIPAC « Chimiothérapie Intra- Péritonéale Pressurisée par Aérosols » qui consiste à délivrer pendant une coelioscopie, au bloc opératoire, une chimiothérapie pour contrôler une carcinose péritonéale et peut être rendre des cas opérables secondairement. Cette méthode s’est avérée améliorer la biodisponibilité locale de la chimiothérapie dans les nodules péritonéaux par rapport au lavage péritonéal classique. Aussi, la concentration en chimiothérapie utilisée serait moins importante. C’est pourquoi, l’objectif est de comparer l’effet de cette technique PIPAC à la simple injection en intrapéritonéale pour l’administration des VEs chargées en chimiothérapie comparée à la forme libre sur l’évolution de la carcinose péritonéale d’origine colique et ovarienne.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus seraient de trouver une alternative au traitement classique de la carcinose péritonéale (chirurgie de cytoréduction suivie d’une CHIP (chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale) qui ne peut être pratiqué sur tous les patients. De plus, ce traitement alternatif engendrerait moins d’effets secondaires car la quantité en chimiothérapie serait moins importante et l’utilisation des VEs permettrait une thérapie ciblée sur les cellules cancéreuses.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris vigiles seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en intrapéritonéale (1 fois 30 secondes). Elles seront soumises à un traitement soit par injection intrapéritonéale (1 à 2 fois par semaine 30 secondes) (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) soit par PIPAC (de la chimiothérapie sous forme libre ou dans le VEs) (1 fois 30minutes) sous anesthésie générale (une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine (100mg/kg) zylazine (10mg/kg) (1fois 30 secondes). Puis sous anesthésie, ils auront un suivi non invasif par bioluminescence pour suivre l’évolution tumorale (3 fois 20 minutes pour les bal/c; 12 fois 20 minutes pour les C57BL/6). A la fin de l’expérience elles auront une injection sous-cutanée de buprénorphine (1 fois 30 secondes) puis 30 minutes après elles seront sous anesthésie générale (isoflurane à 30%) pour réaliser un prélèvement intracardiaque de sang qui permettra une analyse postmortem.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
A la suite de l’injection intrapéritonéale des cellules cancéreuses, les souris développeront une carcinose péritonéale qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence car les cellules injectées expriment la luciférase. Ce suivi sera indolore mais peut engendrer un stress pour l’animal. Aussi, d’après notre expérience sur les modèles de carcinose péritonéale, les animaux ne souffrent pas de la maladie et le suivi par bioluminesce nous permettra d’arrêter la maladie avant qu’elle n’évolue trop. Enfin, nous pourrons observer un risque de mortalité chez les souris qui auront la PIPAC car nous devrons effectuer une laparotomie et, la procédure de PIPAC dure 30 minutes, alors que les autres groupes recevront une simple injection intrapéritonéale. C’est pour cela que les groupes qui auront la PIPAC seront composés de 12 souris alors que les autres seulement de 10 souris.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort à J14 ou à 12 semaines post-injection des cellules CT26-luc ou ID8-luc respectivement par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem; mais aussi de tissus pour être analysés par le service d’anatomopathologie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Pour le remplacement, nous ne pouvons remplacer le modèle murin car pour tester un éventuel traitement (ici analyser l’efficacité de la PIPAC et des VEs chargées en chimiothérapie) les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. Seul l’évaluation de l’effet de la chimiothérapie sous forme libre ou dans les VEs sera analysée in vitro sur les cellules. L’effet d’un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l’efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudier in vivo pour être sûre de son efficacité dans un organisme vivant où il y a différents types cellulaires, et différents tissus qui seront touchés.
2. Réduction
Nous n’avons pas effectué de tests de puissance mais en dessous de 7 animaux par groupe, du fait des variations de nos modèles ou vitesse de propagation de la maladie il y a trop peu de données pour avoir un résultat solide. Compte tenu de notre expérience sur le modèle et de la variabilité observée, un nombre minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire. , 12 quand il y a un risque de mortalité lié à la procédure réalisée. Ce sont des règles de bonne pratique pour toutes expériences en oncologie sur l’animal, utilisant des xenogreffes. Aussi, nous allons utiliser deux groupes de souris contrôles pour 4 groupes de traitement. Cela permettra de diminuer le nombre d’animaux. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d’animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans sacrifice à des temps intermédiaires.
3. Raffinement
Les animaux disposeront une période d’acclimation de 5 jours minimum et seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement (yeux fermés, dos voûté, isolement), l’apparence physique (automutilation, plaies) et la gêne pour se déplacer qui seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux 2 fois par semaine. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements. En cas d’atteinte des points limites, ils seront alors exclus de l’expérience dans les 24heures.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il s’agit de souris femelles immunocompétentes (BALB/c ou C57BL6). Ces types de souris sont utilisés largement dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. Nous utiliserons des BALB/c pour créer une carcinose colique (lignée cellulaire CT26) et des C57BL6 pour créer une carcinose ovarienne (lignée cellulaire ID8). Les souris seront utilisées à l’âge de 7-8 semaines pour ne pas interagir avec les processus de vieillissement et pour qu’elles ne soient pas trop jeunes pour supporter la chimiothérapie.