Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-11-24 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-324179)
21 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce volet couvrant l’imagerie cérébrale d’un projet mené sur deux établissements. Ils subissent une ou deux neurochirurgies pour implanter des électrodes et injecter des virus, des séances d’imagerie sous anesthésie et un contrôle de leur accès à l’eau qui peut provoquer la soif, pour étudier le cortex préfrontal. Le porteur décrit un entraînement par renforcement positif et un suivi de la douleur, tout en prévoyant la mise à mort de chaque singe pour analyser son cerveau. Il affirme que le primate est le « seul choix possible » et que les modèles informatiques restent « rudimentaires ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le cortex préfrontal est une région cérébrale très développée chez les primates. Il gère des fonctions qui permettent la flexibilité comportementale. La perte de ces fonctions caractérise plusieurs maladies psychiatriques. Les mécanismes du cortex préfrontal dans ces fonctions et de ces maladies sont peu connus – il semble notamment important de comprendre comment le cortex préfrontal fonctionne en interaction avec d’autres régions du cerveau. Nous étudierons ces interactions dans ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs – EU1/2 pour la majorité du protocole, et EU2/2 pour l’imagerie cérébrale. Tout d’abord, nous étudierons le dynamique de ces interactions par enregistrement électrophysiologique des neurones du cortex pendant des comportements adaptatifs. Puis nous caractériserons l’impact de perturbations des interactions du cortex préfrontal sur l’activité neuronal et sur les comportements adaptatifs. Nous utiliserons la technique émergente de pharmacogénétique qui permet de modifier l’activité des neurones impliqués dans les interactions, tandis que nous enregistrons cette même activité pour comprendre ce qui change dans le cerveau. Ces techniques invasives nécessitent des sujets animaux, ici des macaques – contrairement à d’autres espèces modèles les macaques partagent plusieurs des zones préfrontales ciblées avec l’espèce humaine. Les connaissances fondamentales acquises par ce projet contribueront à notre compréhension du fonctionnement cérébral et, à long terme, à élucider les mécanismes pathologiques des dysfonctions exécutives.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le principal bénéfice attendu sera donc la connaissance scientifique qui résultera de ces études, comme le projet nous permettra de mieux décrire les mécanismes physiologiques du cortex préfrontal et les mécanismes dans le cerveau des comportements adaptifs. En plus le projet nous permettra de comprendre comment le perturbation des interactions du cortex préfrontal modifient son fonctionnement. Plus largement la compréhension de ces perturbations nous approche à des mécanismes spécifiques des maladies qui en sont liées. Le projet avancera notre compréhension des approches pharmacogénétiques chez les primates, étape essentielle au développement du pharmacogénétique comme traitement médicale chez l’humain.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux recevront un entrainement cognitif avec renforcement positif, dans leur hébergement et dans une salle de test. Les sessions sont de 1–5 heures, 5 jours par semaine, pour la durée du protocole. Après chirurgie, les singes fourniront des enregistrements intracérébraux pendant ses sessions d’entrainement cognitif. Les singes passeront également l’imagerie cérébrale – des IRM, des TEP et des CT sous anesthésie. Chaque séance dur 1-3 heures. Tous les singes passeront une ou deux neurochirurgies – pour l’implantation de dispositifs d’enregistrement neurophysiologique et pour l’injection de vecteurs viraux pour la pharmacogénétique. Les singes recevront des injections intramusculaires d’un ligand pour la pharmacogénétique ou d’une substance de contrôle. Jusqu’à 50 injections par animal, pendant le session de travail. À la fin du protocole, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales, dont au moins une pour une neurochirurgie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d’imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l’implantation d’électrodes, de chambres d’enregistrement, et/ou à l’injection de vecteurs viraux. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l’administration d’analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. L’anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. Les animaux du groupe 5 travailleront dans un environnement d’entraînement en accès libre. Ils seront brièvement maintenus en contention légère, de manière à équiper les implants de carte mémoire et à effectuer les inspections et les soins pour les implants. Les animaux des groupes 1-4 et 6 travailleront dans le cadre traditionnel d’un box expérimental. Ils seront assis dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les animaux seront formés dans le cadre d’un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l’adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
À la fin du protocole les animaux, ayant reçu des injections pour le pharmacogénétique, seront euthanasiés et leur cerveau sera extrait pour analyse histologique, afin d’analyser et de confirmer l’expression des récepteurs pharmacogénétique dans leur cerveau. La validation de l’expression de ces récepteurs dans le tissu post mortem est une étape critique dans la justification des résultats de l’expérience. Le travail histologique, et donc l’euthanasie des animaux, fait donc partie intégrante de l’expérience.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La nécessité scientifique de ce programme de recherche est décrite dans les objectifs de ce projet et est soutenue par les financements accordé. Le projet est spécifiquement axé sur la dynamique neuronale du cortex préfrontal et ses interactions. Cette spécificité rend les alternatives non animales impossibles à mettre en œuvre pour atteindre les objectifs du projet. Les modèles in silico du cortex préfrontal restent rudimentaires pour les questions de dynamique neuronale – en effet, un résultat de ce projet pourrait être l’amélioration de ces modèles. En outre, le projet se concentre sur les interactions du cortex préfrontal avec d’autres régions du cerveau. Non seulement les modèles in silico du cortex préfrontal sont rudimentaires pour l’étude de la dynamique neuronale, mais ils sont rarement connectés à des versions modélisées d’autres régions du cerveau, et jamais avec toute la complexité des connexions dans le cerveau parce que nous ne connaissons ni ne comprenons la forme et la nature de ces connexions. Les assemblages de cellules in vitro peuvent être utilisés pour étudier la dynamique neuronale de base, mais jamais avec les interactions cortico-corticales, cortico-sous-corticales et neuromodulatrices que nous examinerons ici – les préparations in vitro manquent de ces éléments, et l’objectif de ce projet est de rendre compte de l’ensemble des systèmes du cortex préfrontal, ce qui n’est pas possible in vitro. L’étude ex-vivo est impossible pour ce projet car la dynamique neuronale n’est produite que par un cerveau vivant. Pour atteindre les objectifs scientifiques décrits, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs. Seules les espèces de primates possèdent la région du cortex préfrontal latéral granulaire qui est la cible de notre étude. Parmi les animaux de laboratoire acceptés, seules certaines espèces de primates sont capables d’accomplir les tâches cognitives que nous étudions ici. En conséquence de ce qui précède, il n’y a aucune forme de progrès scientifique ou technique dans un avenir prévisible qui permette d’obtenir les informations que nous recherchons ici à partir d’expériences n’impliquant pas d’animaux, et donc nous ne pouvons pas aborder la question du remplacement de ces expériences.
2. Réduction
La taille estimée de la cohorte pour cette étude a été définie en prenant en compte l’impératif éthique d’utiliser le moins d’animaux possible et l’impératif scientifique et éthique d’utiliser le nombre suffisant pour obtenir des données scientifiques robustes, des résultats significatifs et généralisables. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et une reproductibilité des observations. En général, l’approche consiste à concevoir toutes les expériences pour les contrastes et les tests statistiques intra-individuel, puis à tester un deuxième animal pour confirmer les résultats du premier. Cela signifie qu’un singe sert comme son propre contrôle et que le « n » de l’expérience est constitué de sessions ou de neurones. C’est le minimum absolu pour une expérience scientifique correctement réalisée, et notre travail pour réaliser ces expériences de cette manière représente un effort maximal de réduction. Pour toutes les procédures, l’utilisation des interventions pharmacogénétique DREADD pour modifier l’activité des neurones relèvent du raffinement ce qui porte la réduction à son maximum. C’est une intervention réversible qui ne nécessitent pas de lésion et n’impliquent pas de perturbation à long terme. La procédure étant réversible, l’animal peut également agir comme son propre contrôle. Dans chaque groupe principal, deux animaux seront utilisés si les deux fournissent la puissance statistique requise pour l’étude. Un troisième animal a été noté, mais il ne sera inclus que si l’un des deux premiers n’est pas en mesure de fournir des données répondant à ces critères. Nous souhaitons souligner ici que le critère important est, une fois que nous commençons l’expérimentation sur des sujets macaques, de s’assurer que des résultats scientifiques solides et fiables découlent du projet.
3. Raffinement
Nos approches expérimentales font l’objet de raffinements constants. Nous appliquons depuis plusieurs années des protocoles de surveillance accrue de nos animaux, à la fois dans les protocoles et autour des procédures chirurgicales ; nous fournissons des soins péri-opératoires au niveau qui serait attendu en chirurgie humaine dans la mesure du possible ; nous suivons la douleur post-opératoire avec notation et points limites; et tous nos animaux sont entrainés avec un renforcement positif pour chaque élément du protocole. Chaque élément du protocole est suivi avec des points limites gradés adaptés à chaque animal et le protocole et les interventions sont effectués en fonction des discussions régulières avec les vétérinaires et le personnel chargé des soins aux animaux. Notamment, le contrôle hydrique est opéré ici avec un suivi renforcé et un ensemble gradué de points d’intervention et de points d’arrêt, comme décrit par les recommandations nationales du CNREEA. Les techniques et les matériaux d’implantation font l’objet de raffinements réguliers, tout comme le soin des implants et leur suivi à long terme. Les interventions pharmacogénétiques permettent une intervention neuronale directe plus ciblée que les approches précédentes et ne nécessite pas d’injection intra-cérébrale à chaque séance. À terme la validation des injections pharmacogénétiques par TEP et IRM devrait permettre de valider les expériences sans sacrifier les animaux pour une validation histologique. Le travail réalisé ici contribuera à cet objectif, mais une validation post mortem reste nécessaire pour le moment. Le travail des singes testés en « libre accès » représente un raffinement significatif pour l’acquisition de données neurophysiologiques et pour les conditions de travail pour l’animal. Plus précisément, il s’agit d’un raffinement majeur de l’hébergement conformément au protocole, car les animaux sont beaucoup moins fréquemment contraints ou retirés de leur hébergement pour les besoins de l’expérience. Le projet entre autres fournira une base de données pour indiquer dans quels cas ce raffinement spécifique est approprié dans l’avenir.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les expériences chez les primates non-humains sont directement pertinentes pour la compréhension de la cognition humaine, en raison des capacités cognitives du macaque, et des similarités de cerveau. Nos questions scientifiques nécessitent des études chez le singe en raison des proximités anatomiques et biochimiques entre les espèces primates, et de la capacité unique des primates à réaliser des tâches cognitives complexes qui permettent de manipuler, comme chez l’Homme, les capacités comportementales complexes. Nos études sont centrées sur le cortex préfrontal, un cortex granulaire qui parmi les espèces modèles n’a été identifié que chez les primates. L’utilisation du modèle primate permet un transfert direct vers la compréhension du cerveau chez l’Homme. Ceci est renforcé par les connaissances que nous avons acquises, et par nos études comparatives Humain-Macaque. Les animaux sont adultes – les procédures d’implantation sont réalisées à 5-6 ans lorsque le développement crânien se stabilise pour éviter de fortes modifications morphologiques après implantation et des problèmes de localisation stéréotaxique.