Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-11-24 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-424028)
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une chirurgie d’injection dans le cerveau, puis un hébergement individuel, des séjours en cage à métabolisme, un jeûne de 24 heures et un régime gras et sucré, pour étudier une protéine des cellules gliales dans l’obésité. Le porteur indique que la chirurgie échoue chez 55 % des souris, dont la région visée n’est pas atteinte, et que l’isolement et le jeûne causent inconfort et anxiété. Il affirme qu’aucune méthode in vitro ne permet cette étude « sur un animal in toto » et renvoie au long terme les pistes contre l’obésité.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication des . La moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite dans la région cérébrale d’intérêt, permettant de tester sa contribution : 1) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun. Par ailleurs, une partie de ce projet testera la contribution de la connexine 43 dans un contexte de régime enrichi en graisses et en sucres. Nous testerons alors la propension des animaux à prendre du poids et développer un diabète de type 2 lorsqu’ils sont nourris avec ce régime hypercalorique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire, le métabolisme et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales dans la propension des animaux à développer une obésité et un pré-diabète lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre. Nous étudierons les contrôles fins de la prise alimentaire, évaluerons la prise hydrique, les dépenses énergétiques, la réponse au jeûne ou encore de l’activité locomotrice des animaux. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type 2.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pour les procédures impliquant des animaux nourris avec un régime standard, la durée totale du projet est de 5 ou 11 semaines . Pour les procédures impliquant des animaux alimentés avec un régime enrichi en graisses et sucres, la durée totale du projet est de 14 semaines. Toutes les souris ont une intervention chirurgicale de 45 minutes pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux sont ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, soit 4 semaines pour 24 animaux et 10 semaines pour les autres animaux. Après récupération chirurgicale, le poids et prise alimentaire des animaux sont mesurés 2 fois par semaine pendant 10se. Entre la 6 et 7e semaine qui suivent la chirurgie, les souris sont utilisées dans différents test(s) métabolique(s) : – Certains animaux sont hébergés pendant 3 jours dans des cages métaboliques qui mesurent la prise alimentaire en continu et les dépenses énergétiques. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. Ces animaux sont également utilisés dans un protocole de 25h qui mesure la réalimentation consécutive à un jeûne. La moitié des souris est mise à jeun pendant 24h et les autres pendant 21h puis réalimentées pendant 3h. – Pour d’autres animaux, un test de tolérance au glucose (4h), classiquement utilisé pour diagnostiquer un diabète, est utilisé. Une solution de glucose est administrée par voie orale, puis des prélèvements sanguins sont réalisés pour suivre l’évolution de la glycémie (7 prélèvements au cours des 4h). Après le test et selon les résultats obtenus, les animaux seront soumis à un test qui vérifie l’absence d’anxiété, ainsi qu’à un test de préférence alimentaire (plusieurs régimes pour rongeurs proposés pendant 8j). – Certains animaux sont utilisés dans un test de tolérance à l’insuline. Une injection d’insuline est réalisée, puis des prélèvements sanguins sont réalisés de la même façon que pour le test de glucose (7 prélèvements, 4h). -Enfin, des animaux seront utilisés dans deux tests de privation en glucose (par l’administration d’un composé pharmacologique ; durée 4h). Au cours de ce test, des suivis de mesures de la glycémie (7 prélèvements en 4h) seront réalisés, ou des mesures de la prise alimentaire (pendant 4h).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Ce projet nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. Le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale implique une période de récupération post-opératoire qui est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement. Un inconfort et de l’anxiété peuvent résulter de cet isolement. L’hébergement de 3 jours dans les cages métaboliques est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal qui entraîne une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Le suivi du statut glycémique et le diagnostic d’un diabète requièrent des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. Par ailleurs, la modification du statut glycémique cause un inconfort dû à la contention de l’animal et aux administrations des composés modifiant le statut glycémique. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem. Ces analyses comprennent des étude in situ, des analyses biochimiques de marqueurs métaboliques. Elles permettent également de vérifier l’efficacité de la chirurgie dans la région d’intérêt et de caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Les animaux sortis des procédure pour une prise de poids insuffisante sous régiùe obésogène seront sacrifiés et les tissus prélevés afin d’abonder un tissuthèque interne à l’équipe permettant de réaliser des analyses biochimiques tests et/ou des essais immunohistochimiques.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit ici d’étudier le rôle d’une sous population de cellules gliales présente dans une région spécifique du cerveau et de comprendre leur interactions avec les neurones régulant la balance énergétique. Il est capital que ces cellules soient dans l’environnement complexe qui est le leur in vivo et que ne peut pas être reproduit in vitro. De plus l’objectif est ici de voir si la perturbation de la communication gliale modifie le comportement alimentaire, la prise de poids, la régulation glycémique, les dépenses énergétiques… Ces paramètres ne peuvent être abordés que sur un animal in toto et pas in vitro.
2. Réduction
Le nombre maximal de souris nécessaire à ce projet est de 348. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées, avec dans chaque procédure des animaux contrôle. 1) La moitié des animaux reçoit un composé inerte vis-à-vis de la connexine 43 et les autres animaux reçoivent un composé qui réduit la connexine 43 dans notre région cérébrale d’intérêt. Cela constitue la variable « condition d’expression de la connexine 43 ». Pour 2 procédures, la condition d’expression de la connexine 43 est la seule variable et nécessite 2 lots d’animaux. 2) Une partie des animaux est soumise à une modification du métabolisme (jeûne ou régime enrichi en graisses et en sucres). Le statut nutritionnel constitue une seconde variable et les procédures concernées nécessitent 4 lots d’animaux (avec la condition d’expression de la connexine 43). Pour l’ensemble des procédures, 20 lots sont nécessaires. L’effectif nécessaire par lot dépend des paramètres étudiés. Il prend en compte : 1) La variabilité individuelle des paramètres étudiés permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’études bibliographiques ou au cours de précédents projets. Une procédure nécessite 6 animaux inclus dans les analyses finales, et les autres procédures 8 animaux par lot. 2) L’inclusion ou non des animaux dans les groupes statistiques finales. Dans ce présent projet, deux critères d’exclusion sont relevés : a) l’échec des chirurgies. L’intégralité de la région d’intérêt doit être touchée, cela représente 55% des animaux et b) l’échec, pour induire une obésité chez la souris qui peut aller jusqu’à 30 %. Ainsi, pour l’étude de paramètres nécessitant 8 animaux, nous devons utiliser au maximum 8 souris inclues dans les analyses statistiques et prévoir 8 souris exclues des analyses (et 6 souris résistantes au régime enrichi en graisses), soit au maximum 22 animaux par lot de souris soumises à un régime enrichi. Pour les animaux exposés à un régime standard, 16 animaux par lot maximum sont nécessaires. En prenant en compte les critères d’inclusion et d’exclusion, nous nous assurons que les animaux utilisés seront suffisants pour obtenir des résultats scientifiquement valables qui pourront être utilisés par la communauté scientifique.
3. Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entrainé. L’état clinique des animaux est suivi quotidiennement et un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée . Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie est réalisée sous analgésie pré-opératoire et post-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale. Après la chirurgie, un suivi renforcé est mis en place. Durant les 3 jours qui suivent la chirurgie, les animaux sont placés dans une salle de l’animalerie dédiée pour une surveillance accrue. Pendant cette période, une alimentation adaptée limitant la déshydratation et la perte de poids est disposée en fond de cage et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de glycémie sont réalisés après application d’une crème anesthésiante. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde et sous analgésie quand elle est susceptible de générer de la douleur. Pour étudier le métabolisme des animaux nous avons recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non-invasives, la mesure de plusieurs paramètres métaboliques. Les mesures sont effectuées simultanement sur un même animal pour faciliter les études de corrélation entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests nécessitant une mise à jeun, les animaux seront habitués au retrait de la mangeoire pour réduire l’angoisse causée par l’absence de nourriture. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention avant les différents tests métaboliques pour réduire l’angoisse animale et éviter des fluctuations de la glycémie dues au stress de la manipulation et de la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie jusqu’à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes sont disposées afin de permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissemen plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Pour les procédures n’incluant pas l’étude des effets du régime enrichi en graisses, des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. L’anatomie des différentes régions du cerveau est bien connue à cet âge et ce qui nous permet plus aisément de cibler la structure cérébrale. Pour les procédures étudiant l’effet d’un régime enrichi en graisses et en sucre, des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes enrichis en graisses et en sucres peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.