Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 12/03/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-342927)
Pour étudier le rôle de l’acide rétinoïque dans la production des spermatozoïdes, 1 050 souris sont utilisées dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre l’âge de quinze et vingt-neuf jours par perfusion d’un fixateur sous anesthésie létale. Les souriceaux subissent une biopsie de queue dès le premier jour de vie, puis des injections de rétinoïdes, d’inhibiteurs de kinases et d’un traceur cellulaire. Trois mâles sur quatre n’ont pas le génotype recherché et sont tués sans qu’aucun prélèvement soit fait sur eux, et le porteur ajoute 25 % d’animaux pour couvrir un risque qu’il qualifie d' »élevé » d’abandon ou de cannibalisme par la mère, provoqué par la manipulation précoce des nouveau-nés. Il conclut que le remplacement par un système in vitro est « impossible ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La spermatogenèse est le processus de formation des gamètes mâles – les spermatozoïdes, à partir des cellules souches appelées spermatogonies. Ce processus se déroule dans les tubes séminifères du testicule. Une étape cruciale de la spermatogenèse est la méiose, qui permet des échanges entre les gènes, contribuant ainsi à la diversité génétique. Selon la littérature, l’acide rétinoïque, le métabolite actif de la vitamine A, est une molécule essentielle qui régule différentes phases de la méiose. L’inactivation d’un ou plusieurs acteurs de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque conduit à un blocage de la spermatogenèse, entraînant par conséquent l’infertilité. L’acide rétinoïque peut exercer des effets génomiques, en se liant à ses récepteurs dans le noyau de la cellule, mais il peut également induire des effets non génomiques, en régulant des protéines kinases présentes dans le cytoplasme de la cellule. Dans ce projet nous utilisons des souris mutantes (pour les voies de synthèse de l’acide rétinoïque) présentant un arrêt de la spermatogénèse. Chez ces souris mutantes, on note également une sur-activation de certaines protéines kinases dans le testicule. En employant une approche pharmacologique, nous déclenchons de manière contrôlée et simultanée la différenciation de toutes les spermatogonies puis nous administrons différentes substances activatrices de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque ou inhibitrices de tyrosine kinases, afin d’étudier leur implication dans le processus de la méiose. Les testicules des animaux traités servent à réaliser les analyses qui doivent permettre de comprendre le rôle de ces différentes voies dans la méiose.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Des études pharmacologiques montrent un blocage de différenciation des spermatogonies chez l’Homme, lorsque la synthèse de l’acide rétinoïque est bloquée. En comprenant comment les voies de signalisation de l’acide rétinoïque et des tyrosines kinases (potentiellement contrôlées par l’acide rétinoïque) agissent sur les spermatogonies et la méiose chez la souris, nous obtiendrons des pistes pour évaluer si des cas d’infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde, sont liés à des altérations du fonctionnement de ces voies de signalisation. La possibilité de perturber temporairement la signalisation de l’acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). – Biopsie de queue (entre le 1e et le 3e jour) sur animaux vigiles pour génotyper les animaux. Réalisée 1 fois dans leur vie. – Administration d’un médicament à l’âge de 4 jours pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies. Réalisée 1 fois dans leur vie. – Administration d’un médicament à l’âge entre 10 et 12 jours (1 injection pour les rétinoïdes, 3 injections pour les inhibiteurs des kinases) pour sauver les cellules méiotiques de la mort. – Administration d’une molécule traceuse de cellules à l’âge de 10 jours pour suivre l’évolution d’une cellule. Réalisée 1 fois dans leur vie. – Administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale de mise à mort réalisée entre l’âge de 15 jours et 29 jours. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous générons des souris porteuses d’une mutation restreinte à deux types cellulaires du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles. Une biopsie de la queue est réalisée pour le génotypage. La taille de l’échantillon de queue ne dépasse pas 0.5mm pour limiter la nuisance engendrée par cette biopsie. L’administration de substances (rétinoïdes, inhibiteurs de kinases, traceur cellulaire, anesthésique ou analgésique) entraîne une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Après la réalisation du génotypage, les mâles ne présentant pas le génotype d’intérêt seront exclus de la procédure et euthanasiés sans prélèvement (3/4 des mâles). Tous les animaux mutants sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La production de spermatozoïdes, appelée spermatogenèse, est un processus complexe qui implique différentes cellules dans les testicules. Les interactions entre ces cellules sont cruciales pour assurer une production constante de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le rôle de l’acide rétinoïque – métabolite actif de la vitamine A, et des protéines de type tyrosine kinases, qui sont potentiellement régulées par l’acide rétinoïque, dans un contexte physiologique naturel préservant ces interactions cellulaires. Il est donc indispensable qu’une approche expérimentale avec des animaux soit employée pour répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
2. Réduction
Notre étude se concentre sur la production des spermatozoïdes, donc seulement les mâles (environ la moitié des naissances) participent aux expériences. On identifie et prélève un petit échantillon de queue le plus tôt possible afin de déterminer le type génétique et sélectionner les mâles mutants. La suite de la procédure n’est réalisée que pour les mâles mutants sélectionnés. Ils représentent un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Il sera donc nécessaire de quadrupler l’effectif (quadruple). Le risque d’abandon par la mère ou de cannibalisme au cours de la procédure expérimentale est élevé dû à la manipulation précoce des nouveau-nés. Afin de prendre en considération ces risques, nous prévoyons d’augmenter l’effectif des animaux de 25%. Cependant, dès que le nombre de mâles requis pour un traitement donné sera atteint, les prélèvements pour le lot correspondant seront arrêtés, 25% représentant une valeur limite maximale. Par ailleurs, au cours de notre étude, nous serons à même d’estimer plus finement le pourcentage de risque lié à la manipulation des nouveau-nés, ce qui permettra d’ajuster les effectifs et de réduire au maximum l’utilisation des animaux dans les futurs projets. Nous comparons et analysons des groupes de mâles mutants traités de différentes manières (7 conditions au total). Nous analysons l’évolution de la méiose – processus de combinaison des gènes maternels et paternels assurant la formation d’une nouvelle cellule qui va se maturer en spermatozoïde. Nous étudions 2 points clé de la méiose et nous analysons aussi son produit final à un stade plus tardif (3 stades). Nous avons besoin de 10 mâles pour chaque groupe expérimental : 5 pour des analyses de tissu et 5 pour des analyses moléculaires. Nous utilisons le deuxième testicule de chaque mâle pour évaluer l’efficacité des traitements. Les deux testicules sont fixés différemment et utilisés pour deux voire trois types d’analyses, ce qui répond parfaitement à une réduction du nombre d’animaux en accord avec le 2e R de la règle des 3R.
3. Raffinement
Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance de leur état de santé et des soins appropriés (analgésie) est assurée si nécessaire. En cas de souffrance ou d’altération du comportement des animaux, des mesures correctives nécessaires sont prises rapidement en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux étudiés présentent des mutations dans les cellules de Sertoli et les cellules germinales du testicule (Ser-/- ; Germ-/-), ce qui n’induit aucune souffrance car le phénotype attendu se limite à la stérilité des mâles. Ce génotype d’intérêt concerne un quart des mâles produits avec les croisements mis en place, et la proportion ne peut pas être augmentée. Les procédures expérimentales commencent par l’identification des mâles suivie de la biopsie de queue en vue du génotypage. Ces procédures sont conduites au stade P0-3, précédant l’administration du Médicament1 afin de permettre une sélection ciblée visant à traiter exclusivement les animaux mutants d’intérêt. Les procédures expérimentales sont conduites de façon à diminuer le stress de l’animal. Ainsi, dans le cadre de la Procédure 1, les injections des molécules destinées à être administrées le même jour (rétinoïdes et traceur) sont espacées d’un intervalle de 8 heures. Pour assurer le bien-être des nouveaux-nés, des nids sont aménagés dans les cages, offrant ainsi un environnement chaleureux et sécurisé pour les souriceaux. Afin de garantir leur confort, les animaux sont maintenus en groupe avec leur mère jusqu’au moment de l’euthanasie. Ainsi, l’intégration totale du raffinement, conformément au principe du 3e « R » de la règle des 3R, est une caractéristique fondamentale de notre approche expérimentale.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l’Homme, et les facilités de modification de son génome, font d’elle un modèle animal de choix pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court, génome connu, outils moléculaires). Par ailleurs, la souris partage 99% d’identité génétique avec l’homme, et les mécanismes de la spermatogenèse sont conservés chez les deux espèces. Nous induisons la différenciation de toutes les spermatogonies en utilisant une méthode pharmacologique (Médicament1 : acide rétinoïque) à l’âge de 4 jours (P4). Cet âge a été sélectionné afin de correspondre au mieux à la période habituelle de différenciation des spermatogonies chez les souris sauvages, permettant ainsi une comparaison pertinente. Cependant, chez les mutants synchronisés, la méiose ne se finalise pas et les cellules meurent de par l’absence d’acide rétinoïque ou d’une dérégulation des voies qu’il contrôle en aval. Le traitement avec le Médicament2 vise à préserver les cellules méiotiques de la mort. Pour les rétinoïdes, nous envisageons une seule injection à P10 (Médicament1+6 jours). Cet âge a été choisi en raison de l’émergence des premières cellules méiotiques productrices d’acide rétinoïque chez les souris synchronisées, correspondant ainsi à la période propice. En revanche, pour les inhibiteurs des kinases, nous prévoyons une injection quotidienne entre P10 et P12 (Médicament1 + 6 à 8 jours). Cette fréquence de traitement a été délibérément choisie pour garantir une inhibition constante des kinases juste après la période de production d’acide rétinoïque. La méiose dure environ 15 jours chez la souris. Nous analysons l’évolution de la méiose à deux points clé (à P15 et à P19) et nous analysons aussi son produit final (à P29).