Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 15/04/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-354219)
Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d’un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L’infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l’inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d’être greffés, les donneurs d’organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l’absence d’antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l’antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l’Homme.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l’apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l’isoflurane: 1 seule, 1 min
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d’infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : – la reproductibilité de la méthode qui n’est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l’autre ne permettant pas d’assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. – la qualité de l’antigène est différente entre une production d’antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. – la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d’un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.
2. Réduction
La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d’antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d’animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.
3. Raffinement
Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.