Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/09/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-362843)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : – Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation – Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections – Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre – Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d’infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d’autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d’expérience.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
2. Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
3. Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)