Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/07/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-411270)
Trois souris par groupe vont être utilisées en surnombre pour compenser un taux d’échec de 20 % à l’injection dans la veine de la queue, celles dont l’injection rate étant écartées et tuées aussitôt. Elles sont 70 en tout, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de mélanome puis sont gardées quatorze jours pendant que les métastases se développent, avec une perte de poids, une cachexie et des difficultés respiratoires parmi les effets attendus. Le porteur indique qu’aucun modèle in vitro ne reproduit le développement des métastases et l’intégrité des vaisseaux sanguins, et conclut que le projet « nécessite » d’observer l' »organisme entier ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Le projet est la suite d’un projet qui nous a permis de démontrer que le miR-155 est un nouveau facteur stimulant la croissance des vaisseaux sanguins mais qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. En particulier, nous avons établi qu’une exposition au miR-155 entraine une altération de la forme et de la structure des vaisseaux sanguins, notamment en fragilisant la paroi des vaisseaux et ayant pour conséquence de faciliter la formation de nouvelles ramifications vasculaires. Ces ramifications se font par bourgeonnement des cellules endothéliales qui tapissent la face interne des vaisseaux. Le miR-155 est classé comme un biomarqueur du cancer en raison de sa surproduction dans le microenvironnement tumoral de cancers solides (sein, poumon, foie). Dans notre projet nous émettons l’hypothèse qu’un excès de miR-155 d’origine tumorale conduirait à une perte d’intégrité et d’étanchéité des vaisseaux sanguins qui pourrait favoriser la dissémination des cellules tumorales et donc la formation de foyers métastatiques. Dans ce contexte nous souhaiterions déterminer la contribution du miR-155, synthétisé naturellement par des cellules de mélanome, au processus métastatique in vivo. Nous prévoyons d’utiliser un modèle de métastases chez la souris en réalisant une analyse macroscopique des foyers tumoraux pulmonaires complétée par des approches d’immunofluorescence afin d’évaluer l’intégrité des vaisseaux sanguins. En fonction des résultats obtenus, nous tenterons, dans un second temps, de préciser la spécificité et d’élucider le mécanisme de transfert du miR-155 produit par les cellules tumorales pour une action sur les cellules vasculaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous avons montré dans une étude précédente que le miR-155 favorise la formation de vaisseux sanguins mais il génère des vaisseaux anormaux et perméables ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Nous souhaiterions confirmer ces observations dans des souris adultes quand le réseau vasculaire est établi et mature. En particulier, nous souhaiterions déterminer si le miR-155 produit par les cellules tumorales circulantes induit des dommages vasculaires. Cette fragilisation de la paroi des vaisseaux par le miR-155, aurait pour conséquences de faciliter l’échappement des cellules tumorales circulantes et de favoriser le développement de foyers métastatiques. Ainsi, nous pourrions envisager des stratégies pour le cibler (cible thérapeutique) afin de préserver l’intégrité vasculaire et limiter l’apparition de métastases.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une injection de cellules tumorales par souris sera effectuée. Les analyses seront réalisées après 14 jours. Tous les animaux sont concernés par les procédures.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir des conséquences de l’injection de cellules tumorales et tout particulièrement au cours du développement des métastases durant 14 jours. Les effets indésirables et nuisances attendus dans ce modèle et qui seront particulièrement observés afin de déceler un mal-être chez ces animaux sont les suivants : – Perte de poids – Cachexie – Gêne/douleur – Difficulté respiratoires (métastases pulmonaires)
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
14 jours après l’injection (procédure1) ou si un point limite est atteint, les animaux seront directement sacrifiés par du personnel formé et qualifié. Différents tissus seront prélevés pour analyses (ex. : poumons, foie, reins, aorte, yeux,… ) puis fixés pour des analyses macroscopiques et en histologie. En fonction des résultats obtenus sur les premiers animaux, la méthode de mise à mort prévue pourrait évoluer vers une méthode alternative (procédure 2) permettant de fixer profondément les tissus et ainsi faciliter nos analyses. Cette procédure sera elle aussi réalisée par un personnel qualifié.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Certains aspects du projet vont être réalisés in vitro sur des cellules vasculaires d’origine commerciale. En particulier, des co-cultures avec les lignées de cellules tumorales seront réalisées. Cependant, à l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier le développement des métastases et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin…..). Dans ce contexte, la réalisation du projet nécessite d’avoir recours à l’animal afin d’étudier des effets sur l’organisme entier qui ne sont pas approchables in vitro (ex. : formation de métastases, relations avec le système immunitaire à grande échelle, …).
2. Réduction
Basé sur notre expérience et sur la littérature existante, nous devons prendre en compte que le taux d’échec pour les injections par la veine caudale chez la souris est de 20% en moyenne (causes d’échec : résistance à l’injection, bulles et qu’il existe une certaine variabilité intrinsèque au développement des métastases. Afin d’obtenir des études statistiques fiables, nous avons réalisé des analyses de puissance statistique. Suite à ces analyses, nous avons calculé que nous aurions besoin au minimum de 11 animaux utilisables par groupe d’étude lorsque nous utilisons le test statistique adéquat. De plus, pour pallier ce taux d’échec d’injection de 20%, nous tablons donc sur 14 animaux par groupe d’étude, soit 3 souris pouvant être écartées de l’étude en cas de problème d’injection. Par conséquent, 11 animaux par condition seront analysables statistiquement et ceci pour chacun des 5 groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d’animaux, les expériences en place sont étudiées afin de recueillir le maximum de données et d’échantillons biologiques. C’est la raison pour laquelle nous recueillerons les poumons (site privilégié pour la formation de métastases dans le cas du mélanome) et d’autres d’organes d’intérêt (ex. : foie, reins, aorte, yeux… ), lors du sacrifice des animaux. Ceux-ci seront utilisés aussi bien pour des études à l’échelle macroscopique (dénombrement des foyers métastatiques) que microscopique (histologie). Des morceaux de tissus seront aussi congelés pour des analyses transcriptomiques et protéiques, a posteriori.
3. Raffinement
L’élevage est supervisé par le personnel compétent de l’animalerie. L’hébergement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate ou polysulfone. Afin de réduire le stress des animaux, une phase d’habituation sera mise en place en cinq séances sur deux semaines avant le début de la procédure. Cette période permettra de les familiariser progressivement au déplacement vers la salle d’expérimentation ainsi qu’à la manipulation. Concernant les problèmes inhérents aux injections, tous les animaux dont l’injection n’aura pas été maitrisée seront écartés de l’étude et immédiatement sacrifiés par du personnel qualifié pour ne prendre aucun risque. Les injections seront réalisées sous anesthésie, induisant une analgésie modérée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans la recherche en oncologie, la souris constitue un modèle pertinent qui présente l’avantage d’être très documenté d’un point de vue des protocoles développés par la communauté scientifique étudiant la croissance tumorale et le processus métastatique. L’étude de la formation de métastases pulmonaires dans les modèles de cancer peut s’effectuer par la formation de métastases provenant de la tumeur primaire et nécessite donc une implantation de cellules dans un organe. Cependant, en se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait qu’une injection de cellules tumorales chez la souris constitue un procédé plus rapide, plus efficace en termes de formation de métastases, et moins sévère du point de vue chirurgical, en vue d’étudier ce processus. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 7-8 semaines minimum. En dessous de cet âge, les animaux ne sont pas assez matures. En particulier, les poumons et le système vasculaire ne sont pas complétement développés, ce qui pourrait interférer avec nos résultats car nous souhaitons étudier l’effet du miR-155 sur les vaisseaux matures.