Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/05/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-415616)
6 312 souris mâles génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant cinq injections en une semaine et jusqu’à trois prélèvements sanguins. Certaines sont suivies jusqu’à deux ans et voient leurs lésions évoluer vers des tumeurs volumineuses, avec douleur abdominale, posture voûtée et perte de poids parmi les signes attendus. Le point limite retenu est une prostate de la taille d’une bille à la palpation, qui déclenche la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever la prostate et d’autres organes, le bénéfice avancé se limitant à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme marqueur diagnostique ou comme cible thérapeutique.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l’activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d’inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l’homme [4]. À noter que l’inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d’adénocarcinomes et favorise l’apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l’expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d’information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l’efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L’objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Suite à l’injection, une infection peut se développer au niveau de l’abdomen de la souris dans les journées suivantes l’injection, dans ce cas la souris sera sortie de l’étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les lésions précancéreuses (PIN), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l’animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l’étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l’anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l’homme ne sont pas ethique puisqu’elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d’éventuelles cibles thérapeutiques.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l’hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d’imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
3. Raffinement
Pour l’ensemble des animaux, des points limites stricts et spécifiques au projet seront utilisés. Les points limites de l’expérience seront un volume de prostate après palpation de la taille d’une bille et le poids de la souris. Si la prostate devient volumineuse, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est trop importante ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Lors de l’anesthésie, une secheresse occulaire et une diminution de la temperature corporelle peut apparaitre. Aucun effet secondaire n’a été rapporté pour les molécules utilisées dans cette étude. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intraperitoneales (IP). Lors des examens d’imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l’aide d’une sonde rectale et d’un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d’imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l’isoflurane (air ambiant). La durée d’analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d’assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). De plus, ils seront manipulés en évitant tout effrayement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.