Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/01/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-418080)
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation d’élastase dans la trachée par une incision au cou pour provoquer un emphysème, des injections répétées de tamoxifène pouvant causer une péritonite, puis leurs poumons sont prélevés 21 ou 90 jours plus tard. Le porteur affirme qu’aucune méthode sans animal ne permet d’isoler les cellules pulmonaires vieillissantes en cause et justifie ainsi le recours à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de BPCO, une éventuelle médecine réparatrice des alvéoles, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, l’objectif immédiat étant de caractériser ces cellules.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) peut entraîner des complications chez l’homme comme la perte progressive des alvéoles pulmonaires. Dans les poumons des patients atteints par cette maladie, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Nos données préliminaires montrent que la délétion de p16 ou l’élimination des cellules vieillissantes corrige les lésions alvéolaires chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules vieillissantes bloquent la régénération alvéolaire et expliquent le manque de réparation dans cette maladie. Ainsi, l’objectif du projet est d’étudier le devenir et les propriétés non régénératives des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte d’alvéoles liée à la BPCO. La connaissance des propriétés non-régénératives des cellules épithéliales vieillissantes nous permettra de confirmer l’effet délétère de ces cellules sur la réparation des tissus. Si notre hypothèse est validée, nous pourrons ensuite envisager l’utilisation de sénolytiques, molécules permettant d’éliminer les cellules sénescentes, et ainsi restaurer les alvéoles pulmonaires dans l’emphysème pulmonaire chez l’homme. Pour cette étude, nous utiliserons des souris ayant des cellules vieillisantes exprimant le gène p16 fluorescentes, permettant de les isoler et les caractériser au niveau épithélial par différentes analyses.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous anticipons l’identification : i) de(s) mécanisme(s) de l’effet délétère des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte alvéolaire, ii) une ou plusieurs sous-populations épithéliales aux capacités régénératives modulées par les cellules p16 vieillissantes. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée. La caractérisation des cellules délétères et des cellules régénératives permettera l’identification de biomarqueurs (caracteristiques biologiques mesurables) d’un processus de régénération réussi ou non. Ce processus serait la dernière étape avant d’envisager le lancement d’un essai clinique pour tester un médicament régénératif identifié avec la plus grande chance de succès. Au total, nous espérons que ces avancées élargiront le champ de la médecine réparatrice aux patients atteints de ces maladies caractérisées jusqu’à présent par une perte terminale et irréversible des alvéoles conduisant à un handicap respiratoire majeur.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour activer l’expression de la protéine fluorescente dans notre modèle, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen en injection intra-péritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l’injection. Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. Nous utiliserons sur ces mêmes souris le modèle d’emphysème induit par l’élastase qui consiste en une instillation intratrachéale unique d’élastase. L’élastase est instillée à l’aide d’une aiguille directement dans la trachée. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter. Les souris seront mises à mort à 21 et 90 jours après l’instillation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysèmateuse ayant des cellules p16Pos fluorescentes permettra d’étudier directement les cellules responsables de la non régénération qui sera uniquement lié à l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 40, correspondant au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 40 souris seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : – Caractériser les cellules épithéliales vieillissantes dans les poumons des souris emphysémateuses : 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Malgrés le nombre de cellules limités que nous pouvons analyser (limite de cette technique), nous utiliserons 4 souris par condition pour lisser la différence inter-individu. – Tester les propriétés des cellules souches en formant des organoides alvéolaires avec des cellules p16Pos vs p16Neg : 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Nous avons besoin d’une quantité suffisante de cellules pour faire au moins 6 puis d’organoïdes (correspondant à 6 souris) par condition pour obtenir un résultat significatif. Le choix du nombre d’animaux pour ce projet a été déterminé par rapport aux précédentes expérimentations effectuées sur des souris utilisées dans le cadre d’un autre projet.
3. Raffinement
Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l’animalerie, avec une attention particulière sur l’aspect des animaux traités. Il y aura un présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constituront des critères d’arrêt et conduiront à la mises à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l’homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. De plus, ce modèle est très utilisé dans la littérature pour étudier l’emphysème plutôt que, par exemple, le modèle d’exposition à la fumée de cigarette qui implique une exposition longue et pénible pour des animaux : 2h par jour pendant 6 mois pour obtenir un emphysème léger. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.