Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 25/08/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-424586)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration et surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré) Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie. Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et forme des assemblages protéiques anormaux (les agrégats) non fonctionnels. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC. Des approches utilisées chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettront d’étudier la commande centrale respiratoire, d’identifier l’agent anti-agrégats le plus efficace et d’enregistrer l’activité des neurones respiratoires avec ou sans agents anti-agrégats, qui participent à la détection du CO2 dans l’organisme et à la mise en place de la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’agents anti-agrégats sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC. MODIFICATION : l’ajout d’administration de molécule et de test physiologique nécessite une modification du projet initial sans ajout d’animaux.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’inhibition de la formation d’agrégats protéiques pourrait potentiellement : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes. 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles. 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des agents anti-agrégats au niveau de la commande respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les agrégats impactent la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les souris mutantes et contrôles, nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles (1 fois entre 12 et 15 jours) puis adultes (3 fois entre 1-6 mois) recevront une administration de deux solutions (48 heures séparent les 2 administrations) selon deux techniques : une sur animal sous anesthésie générale (10 minutes maximum) et l’autre sur animal vigile (moins de 10 secondes). Une mesure non invasive de la ventilation sera réalisée 1 fois chez les souris juvéniles puis 3 fois chez ces souris adultes pendant 60 min à chaque fois (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. L’acclimatation des animaux à ces enceintes a lieu pendant 1 heure par jour pendant les 5 jours qui précèdent l’enregistrement (hors week end). L’hébergement individuel des animaux est limité au maximum.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale. L’administration intrapéritonéale (au niveau de l’abdomen) des deux solutions apparaît comme une source de douleur/un stress de courte durée. L’acclimatation aux enceintes de pléthysmographie et les mesures de ventilation pourront entrainer un stress social de courte durée chez les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire et aux neurones qui élaborent cette commande, dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail réalisé à partir de souris vivantes. L’étude de l’influence d’agents anti-agrégats sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par le(s) agent(s) anti-agrégats ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
2. Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (1182 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
3. Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes. L’isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. Lors des administrations intranasales d’agents pharmacologiques, sous anesthésie gazeuse, avant l’enregistrement de leur ventilation, les souris sont sous surveillances accrue, jusqu’à leur réveil complet pour ainsi éviter l’arrivée de points limites (irrégularités respiratoires, obstruction des voies aériennes, arythmie cardiaques) et prévenir le décès non souhaité des animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude de la respiration et de son contrôle nerveux. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour le gène responsable de la maladie. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès, chez ces souris mutées, au réseau de neurones qui contrôle la respiration à différents âges (stade nouveau-né et juvénile) pour l’étude de l’influence des agents anti-agrégats sur l’activité de ce réseau ; et d’étudier la respiration des souris (juvéniles et adultes) vigiles et de l’effet des agents anti-agrégats sur celle-ci, appliqués de deux façons différentes aux souris.