Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-07-02 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-429274)
14 305 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans l’oreille interne, certaines in utero au quatorzième jour de gestation, puis un suivi auditif toutes les deux semaines pendant six à neuf mois. 972 d’entre elles subissent en plus un test de réflexe de sursaut d’une heure par jour, et d’autres une pièce de maintien posée sous anesthésie suivie de quatre semaines de restriction hydrique, avec deux heures de test quotidien. Le porteur indique qu’il n’existe ni lignée cellulaire ni cellule souche de l’oreille interne et conclut que le modèle murin reste « l’outil indispensable ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
L’objectif principal de ce projet est de développer des thérapies géniques pour restaurer l’audition et l’équilibre dans des modèles murins de pathologie de l’oreille interne humaine, applicables aux patients. Les fonctions d’audition et d’équilibre des mammifères reposent respectivement sur la cochlée et le vestibule, organes sensoriels spécialisés dans l’oreille interne. La surdité et les défauts de l’équilibre sont les troubles sensoriels héréditaires les plus répandus chez l’homme. Environ 1 nouveau-né sur 700 est affecté par une surdité congénitale, dont 80 % ont une cause génétique, avec 30 % de ces cas associés à des troubles de l’équilibre. A ce jour, il n’existe aucune approche thérapeutique pour soigner la surdité et les troubles de l’équilibre. Cependant, les virus adéno-associés (AAV) sont récemment apparus comme des vecteurs prometteurs pour la thérapie génique (TG). Bien qu’elle se soit révélée encourageante dans les essais précliniques et cliniques pour divers troubles héréditaires, la TG n’a pas encore été utilisée pour traiter la perte auditive. Au cours de la dernière décennie, nos recherches se sont concentrées sur le développement de la TG virale pour restaurer l’audition et l’équilibre chez des modèles murins de surdité humaine. Récemment, nous avons rapporté la première preuve de principe selon laquelle la TG peut inverser le phénotype de surdité profonde d’un modèle murin, suscitant l’espoir de futurs essais cliniques chez certains patients. Néanmoins, de nombreux défis persistent. Premièrement, le début de l’audition se produit après la naissance chez la souris et in utero chez l’homme, ce qui rend difficile la transposition des fenêtres temporelles thérapeutiques murines aux patients. Cela implique que la TG doit être administrée à l’oreille interne de souris (mâles et femelles sans distinction) presque adultes. Cependant, le taux de transduction des cellules sensorielles auditives et vestibulaires par les AAV diminue considérablement avec l’âge, soulignant le besoin crucial d’identifier de nouveaux variants AAV avec un fort tropisme pour ces cellules. Deuxièmement, il est essentiel de déterminer si la TG périphérique restaure une perception auditive centrale normale étant donné qu’il existe une période critique (PC) de plasticité, au cours de laquelle les circuits auditifs centraux perdent progressivement leur capacité à encoder correctement de nouveaux signaux acoustiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Notre projet de recherche vise à apporter une contribution significative à la compréhension de la physiopathologie de l’oreille interne et des voies auditives. Les résultats de notre étude devraient non seulement avoir un impact décisif sur le développement d’approches thérapeutiques pour les surdités humaines héréditaires, mais aussi mettre en lumière le rôle crucial de la thérapie génique dans la restauration de la perception auditive et des troubles de l’équilibre dans les modèles animaux de déficiences de l’oreille interne chez l’homme. En étudiant la faisabilité et la fiabilité de la thérapie génique pour restaurer l’audition et l’équilibre dans des modèles murins de surdité humaine, dans une fenêtre temporelle transposable à l’homme, nous espérons avoir un impact significatif sur la santé et la société. En effet, l’acquisition anticipée de connaissances sur l’impact de la fenêtre temporelle et de la période critique sur la thérapie génique pour la surdité, ainsi que l’identification de vecteurs spécifiques à l’oreille interne, seront cruciales pour la conception des futurs essais précliniques. Ces avancées auront à leur tour des répercussions médicales, sociales et économiques majeures, étant donné le fardeau considérable que représente la surdité pour la santé publique et les interactions sociales.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
– Une biopsie (30 secondes) sera effectuée sur tous les animaux du projet afin de les marquer et de les génotyper. – Nous effectuerons des injections (environ 20 minutes) à différents niveaux du système auditif via différentes voies d’administration. – Un suivi audiologique (environ 20 minutes) sera réalisé sur nos modèles souris ayant reçu une injection de vecteurs Cette procédure sera répétée tous les 2 semaines pendant 6 à 9 mois de vie de l’animal. – Nous effectuerons un suivi comportemental des modèles souris de surdité humaines ou de synaptopathies. Un test de réflexe de sursaut sera effectué une fois par jour (environ une heure) pendant 2 à 3 jours par intervalle de deux semaines sur une période de 2 à 3 mois (n= 972 animaux. Un autre test impliquant la pose au préalable d’une pièce de maintien (sous anesthésie, durée une heure) puis l’application d’un protocole de restriction hydrique, aura lieu tous les jours (environ 2 heures) pendant 4 semaines. Enfin, des tests locomoteurs vestibulaires (30 minutes pour l’ensemble des tests) auront lieu tous les 15 jours sur une période de 1 à 5 mois.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
A l’exception du modèle murin du syndrome d’Usher de type 1G qui présente un défaut vestibulaire bilatéral, se caractérisant par un hochement de tête et une tendance à tourner en rond en permanence, nos autres modèles murins ne manifestent, outre la surdité, aucun autre symptôme et leur phénotype est indiscernable de celui des souris sauvages. Pour les mesures perceptuelles, les souris peuvent être soumises à du stress et de l’angoisse pendant les épisodes de contention. De plus, le protocole de restriction hydrique peut entraîner une perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés empêchant tout replacement ou adoption. Par ailleurs, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations de physiologie, ou d’immunohistochimie. Les autres procédures impliquent des interventions comme des injections ou des entraînements comportementaux auditifs ou des chirurgies. On ne peut donc pas considérer ces animaux comme naïfs expérimentalement. De plus, la plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par exemple par d’autres équipes, encore plus difficile. Leur réutilisation pourrait donc mettre en péril les conclusions des nouvelles expériences car trop de paramètres pourraient ne pas être contrôlés. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles. Ces partages se font typiquement à l’échelle de l’Institut au-delà de notre équipe de recherche.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Près de 100 gènes responsables de surdité chez l’Homme ont été identifiés, mais autant restent à découvrir. La restauration de l’audition par thérapie génique chez des souris modèles de surdités humaines représente une étape cruciale pour ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme. A ce jour, nous ne disposons ni de lignées cellulaires ni de cellules souches de l’oreille interne, en raison de la complexité anatomique et histologique de l’organe de l’audition. Dans ce contexte, le modèle murin reste l’outil indispensable pour étudier la physiopathologie des surdités et mettre au point des traitements curatifs. Afin de réduire le nombre de souris utilisées, l’expression de la totalité des gènes thérapeutiques utilisés dans ce projet a été testée préalablement sur des lignées cellulaires.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Afin de minimiser l’utilisation des animaux, nous adopterons une stratégie d’expérimentation et de statistiques visant à obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au strict minimum le nombre d’animaux impliqués. Pour chaque modèle murin, nous réaliserons une injection de vecteur à différents stades du développement. Les souris ainsi injectées seront ensuite utilisées dans plusieurs protocoles distincts, incluant des tests auditifs, comportementaux, des analyses électrophysiologiques et des marquages immunohistochimiques. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons dans la mesure du possible un nombre équivalent de mâles (50%) et de femelles (50%), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage recevront au moins 2 traitements différents. Enfin, les groupes d’animaux sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10% minimum. Cette approche statistique rigoureuse vise à minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant une évaluation fiable et significative des résultats.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Dans le souci du bien-être optimal des animaux tout au long des procédures expérimentales, des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés au stade de développement des animaux en pré-opératoire et post-opératoire afin d’assurer une analgésie optimale pour chaque procédure. Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera soigneusement réalisée. Des tapis chauffants seront utilisés pour limiter le risque d’hypothermie lors des chirurgies. Les souris gestantes seront placées dans des cages isolées après la chirurgie, assurant ainsi un rétablissement dans un environnement calme. De plus, un gel buvable et de la nourriture humidifiée seront disposés sur la litière de leur cage pour permettre aux souris d’accéder à la nourriture sans exercer de tension sur les sutures. Durant une période minimale de 5 jours suivant la chirurgie, une surveillance attentive de la plaie sera effectuée afin de détecter tout signe éventuel d’infection. Le suivi systématique de l’état général de santé des souris sera suivi pendant une semaine après la procédure afin de détecter d’éventuels signes de souffrance ou d’inconfort, tels que les changements de posture, les yeux plissés ou manque de toilettage. Enfin, en vue d’enrichir leur environnement, un igloo en plastique sera ajouté à chaque cage.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
Près de 95% du génome de la souris est identique à celui de l’Homme. De plus, les modèles murins utilisés dans ce projet miment fidèlement les formes de la surdité humaine. Grâce à la transposabilité des résultats entre la souris et l’Homme, nos résultats devraient faire progresser de manière significative notre compréhension de la fonction de la synapse auditive et accélérer le développement de la thérapie génique en tant qu’alternative prometteuse pour un traitement curatif des surdités génétiques chez l’Homme. Preuve en est, les résultats antérieurs provenant d’une étude sur un modèle murin de surdité humaine, ont jeté les bases du premier essai clinique en cours. Nous proposons d’injecter les préparations virales à différents stades clés du développement et de la maturation du système auditif : afin de déterminer la fenêtre temporelle qui permet une meilleure restauration des fonctions auditive et/ou vestibulaire pour chaque surdité traitée. 1) Dans l’hypothèse où l’apport du gène serait trop tardif par rapport à la mise en place de la machinerie de mécano-transduction des cellules sensorielles auditives (à E15), une solution possible serait d’effectuer la thérapie génique avant la mise en place de la touffe ciliaire. Nous allons donc effectuer des injections in utero dans l’otocyste à l’age de 14 jours embryonnaires (E14). 2) immédiatement après la naissance, entre le premier et le troisième jour postnatal (P1 à P3) 3) à un stade mature de l’audition (entre P15-P30) Les tests auditifs seront réalisés chez des souris âgées de 21 jours à 30 semaines afin de pouvoir évaluer la restauration de l’audition dans le temps. Les mesures de patch-clamp sont effectuées sur des cochlées de souris âgées entre P20 et P35. Les tests comportementaux seront réalisés 30 à 45 jours post-traitement.