Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-498298)
1 425 souris immunodéprimées vont être utilisées, la plupart tuées à l’issue et soixante reproductrices réutilisées, dans des procédures de gravité légère à modérée. Elles reçoivent la greffe d’un tissu dans le pavillon de l’oreille puis l’injection de cellules tumorales humaines, suivies d’un traitement candidat et d’un suivi par imagerie, pour mettre au point un modèle de xénogreffe. Le porteur décrit des risques d’ulcération, de démangeaisons et d’automutilation au site de greffe. Il présente ce modèle comme un « raffinement » réduisant l’invasivité des greffes en oncologie et affirme « indispensable » le recours à l’animal, la culture cellulaire ne reproduisant pas l’environnement tumoral.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La recherche en oncologie est principalement menée sur la souris en injectant des cellules en sous cutanée ou en réalisant des greffes au niveau des organes concernés. Ces protocoles éprouvés permettent de réaliser la recherche de nouveaux traitements toujours plus efficaces. Cependant, ces méthodes présentent des limites qui sont le tissu non spécifique pour les injections en sous cutanée et l’inaccessibilité des cellules tumorales suite à la greffe de celles-ci. Ce projet vise à générer un nouveau modèle en oncologie qui permettrait de réduire et raffiner les approches d’expérimentation animale avec techniques de greffe et d’injection de cellules, mais également de se rapprocher toujours plus des conditions physiopathologiques des cancers dans lesquels le microenvironnement de la tumeur joue un rôle important. Il s’agit d’un modèle de xénogreffe humanisée dans le pavillon de l’oreille de souris immunodéprimées : un tel site, directement accessible à une observation facile in vivo notamment par imagerie par transparence, offre la possibilité d’un suivi dans le temps par imagerie in vivo ce qui de facto réduit le nombre d’animaux nécessaires. Pour élaborer notre modèle, nous utiliserons une lignée de souris immunodéprimée NSG et donc tolérante à différents types de greffe ou d’injection. Dans un premier temps, le tissu cible des cellules tumorales sera greffé afin de créer l’environnement favorable facilement accessible pour y injecter dans un second temps les cellules tumorales. Les cellules tumorales se retrouveront alors directement dans leur tissu de prédilection, au plus proche des conditions retrouvées lors des pathologies. Si ce modèle se montre concluant (croissance tumorale et vascularisation), des molécules à visée pharmaceutique connues seront testées. Grâce à l’étude de tissus humains dans un environnement in vivo, un tel modèle peut offrir une méthode au plus proche des conditions physiolopathologiques retrouvées chez les patients atteints par un cancer. Dans une logique de médecine du futur, ce modèle permet d’envisager une étude personnalisée de la maladie d’un patient afin de déterminer le traitement le plus efficace.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus de ce projet sont tout d’abord de proposer un modèle innovant en oncologie et tout autre champ d’application comme par exemple les maladies neurodégénératives, la virologie etc… Ce modèle utilise l’oreille de la souris comme tissu cible de la greffe ou de l’injection. Les feuillets très fins qui composent ce tissu le rendent presque transparent ce qui permet de réaliser, de manière simplifiée, un suivi in vivo des processus cellulaires par fluorescence. Ces suivis sont déjà réalisables mais nécessitent une procédure expérimentale lourde pour l’animal, ou un faible niveau de résolution optique. Avec des cellules préalablement marquées à l’aide de fluorochromes, ce modèle permet une accessibilité facilitée à l’acquisition des processus cellulaires in vivo et donc à la réalisation d’études cinétiques du suivi de l’évolution tumorale. Ce projet permettra aussi d’étudier différents types de cellules tumorales dans un tissu humanisé et préalablement greffé. En effet, une grande partie des études en oncologie utilise des injections sous-cutanées pour faciliter l’étude des cellules tumorales. Ici, il est proposé d’injecter des cellules tumorales directement dans leur tissu cible, afin d’avoir un modèle plus proche des conditions pathologiques. De plus, ce modèle permettra un raffinement des greffes chez la souris puisque seule l’oreille sera opérée, avec une cicatrisation très simple, en remplacement d’interventions chirurgicales plus invasives en fonction du type de greffe. En plus de faire progresser et d’étoffer les connaissances scientifiques en oncologie, ce projet permettra d’établir un nouveau modèle qui permettra à terme de limiter le nombre d’animaux utilisés, d’alléger les interventions, et de faciliter l’accès à l’imagerie in vivo
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
En fonction de la procédure, les animaux seront soumis au maximum à une intervention chirurgicale d’une trentaine de minutes pour greffer le tissu dans le pavillon de l’oreille. Cette greffe pourra être suivie par une injection de cellules tumorales dans le greffon 2 semaines après (intervention d’une quinzaine de minutes). Ces deux actes seront effectués sous analgésie et anesthésie générale. Deux semaines après, les souris seront soumises à minima à une contention de quelques minutes et à maxima à une anesthésie générale de 15 minutes pour réaliser l’imagerie. L’acquisition des images n’est pas invasive pour l’animal et sera répétée toutes les deux semaines jusqu’à la fin de la procédure. Une semaine après l’injection des cellules tumorales, l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée par injection sous anesthésie (15 minutes).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Des effets indésirables suite à la greffe de tissu dans l‘oreille pourraient être observés chez les animaux, même si une procédure expérimentale récente rapporte qu’en pratique ce n’est pas le cas. Les souris pourraient présenter une ulcération au niveau de la greffe deux à trois semaines après celle-ci, ou une gêne pouvant conduire à des phénomènes de démangeaisons voire, à l’extrême, de la mutilation. Les souris seront surveillées quotidiennement suite à la greffe. L’implantation de tumeurs chez la souris est une technique éprouvée et publiée par de nombreux laboratoires depuis plusieurs années, ce qui nous permet d’avoir du recul sur les nuisances ou effets indésirables attendus. Il se peut que ces souris perdent du poids une à deux semaines après l’injection des cellules tumorales ou qu’elles présentent une ulcération au niveau de la tumeur deux à trois semaines après l’injection des cellules tumorales. Le développement de ces tumeurs et/ou l’apparition de métastases ont un impact sur la santé de l’animal, dont les premiers signes sont un amaigrissement et des modifications comportementales. De ce fait, le suivi du poids des animaux et d’une échelle d’évaluation du bien-être animal informeront sur l’état des animaux. Ces points limites sont susceptibles d’évoluer dans le but d’être plus performants à détecter la moindre souffrance de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour d’autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés, ce qui s’avère nécessaire pour rechercher et étudier les mécanismes permettant le maintien de la greffe mais aussi l’évolution des cellules tumorales en fonction de l’environnement dans lequel elles sont assignées. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Ce projet propose d’optimiser un modèle murin pour les études en oncologie. De ce fait, l’utilisation d’animaux pour mettre au point ce nouveau modèle et indispensable. Au niveau oncologique, de nombreuses caractérisations ont déjà été effectuées en culture cellulaire, comme l’analyse des biomarqueurs ou l’activité des cellules immunitaires. Il s’agit maintenant d’évaluer la croissance tumorale et son développement in vivo. Pour ce faire, le modèle animal est requis afin d’évaluer la croissance tumorale dans un environnement adéquat. En effet, les greffes de tissu et/ou les cellules cancéreuses ont besoin de multiples signaux pour croître correctement, d’une interaction avec les différents tissus et en particulier avec le système vasculaire de l’hôte, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. De plus, nous nous intéressons ici à l’environnement tumoral et son influence sur le développement de la tumeur. Pour évaluer toutes ces interactions avec les différents tissus et/ou types cellulaires, le modèle animal ne peut être remplacé par un autre modèle qui ne représenterait que partiellement un organisme.
2. Réduction
Dans la littérature spécialisée, les expérimentations de mise au point sont habituellement réalisées sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes par condition. Chaque procédure ayant des objectifs distincts, le nombre d’animaux ainsi que le nombre de répétition maximum sont amenés à varier. Les procédures « preuve de concept » nécessite un nombre d’animaux moindre que les procédures visant à valider une hypothèse. Pour les procédures suivantes, la significativité des résultats sera obtenue par des tests appropriés . Pour ces expériences, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde (et dernière) répétition ne sera pas effectuée.
3. Raffinement
Ce projet a pour objectif le raffinement des procédures expérimentales appliquées aux les animaux. En effet, pour des études avec des cellules tumorales dans le tissu homologue de la souris, il s’agit d’effectuer une chirurgie invasive (par exemple pour le cancer du rein). Ici nous proposons un raffinement avec une opération limitée au niveau l’oreille de la souris, et ne nécessitant que de la colle chirurgicale pour refermer le feuillet tissulaire décollé, ce qui est de facto moins traumatique. Du fait de la translucidité liée à la finesse des feuillets tissulaires de l’oreille, il sera possible d’étudier des processus à l’échelle cellulaire par imagerie in vivo, sans procédure expérimentale lourde pour l’animal ou avec une résolution supérieure grâce à la transillumination du tissu. De plus ce modèle permettra aussi de réduire le nombre d’animaux lors d’études cinétiques dans le temps, le même animal étant suivi de manière non invasive à différents points de la cinétique. Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement adapté à leur statut immunodéficient (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion, cages avec couvercle filtrant à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens avec la mise en place de point limite , sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal au niveau de l’équipe locale de la structure. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards. Suite à une procédure expérimentale, une attention particulière aux signes de douleurs et de stress sera portée tout au long de l’expérimentation. Les souris présentant ces signes recevront des analgésiques, en accord avec le vétérinaire.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour réaliser notre projet, nous nous appuyons sur des bases bibliographiques solides et différentes données déjà publiées, que nous comparerons à celles obtenues avec notre nouveau modèle. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines et pesant de 20 à 25g, ce qui, d’après la littérature scientifique, correspond au stade de développement optimal pour réaliser des greffes de tumeur chez les souris immunodéprimées .