Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-09-12 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-502101)
Les souris de la lignée TgM83 portent une protéine humaine mutée qui déclenche chez elles, vers huit à dix mois, des troubles moteurs de type parkinsonien. 24 d’entre elles vont être utilisées, douze dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, douze dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. La moitié subit une chirurgie crânienne pouvant durer une heure, puis vit isolée une semaine sur deux pendant dix-huit semaines, le temps d’enregistrer leur sommeil de trois à dix mois d’âge. Toutes sont tuées par perfusion transcardiaque sous anesthésie terminale, pour que leur cerveau soit examiné avant l’apparition des signes moteurs de la maladie.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal anticipe d’une décennie la maladie de Parkinson dont il est considéré comme le meilleur marqueur précoce. Pendant le sommeil paradoxal, nous sommes naturellement paralysés. Cette paralysie est absente chez les patients atteints du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Nous faisons l’hypothèse que la zone cérébrale contrôlant cette paralysie serait une cible précoce des mêmes processus pathologiques que ceux responsables de la maladie de Parkinson et qui envahiraient au cours du veillissement l’ensemble du cerveau.Notre objectif est de tester cette hypothèse sur une souche de souris de type transgénique (TgM83), fréquemment utilisée pour la recherche sur la maladie de Parkinson, qui expriment une protéine humaine mutée responsable d’une forme génétique de cette maladie neurodégénérative. Différentes études comportementales indiquent que les souris TgM83 présentent des altérations motrices sévères de type parkinsonien dès l’âge de 8-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est perturbé en amont de ces signes cliniques, comme chez les patients parkinsoniens.Ce projet nous permettra de caractériser le sommeil des souris TgM83 porteuses de la pathologie, de prévoir l’émergence de la maladie de Parkinson à la détection de symptômes précoces durant le sommeil et enfin d’étudier la propagation cérébrale de la pathologie au cours du veillissement.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal est pour les médecins un symptôme neurologique précoce et fiable de la Maladie de Parkinson. En effet, il serait l’un des premiers signes visible et facilement identifiable à l’hôpital qui survient une dizaine d’années avant les symptômes moteurs invalidants bien connus. Par ailleurs, ceci suggère que ces deux pathologies sont chronologiquement liées et partageraient des mécanismes pathologiques communs qui envahiraient de façon lente, insidieuse et presqu’invisible, le cerveau au cours du vieillissement chez les patients. Notre objectif est de tester cette hypothèse en profitant de l’opportunité expérimentale que nous offre une souche de souris exprimant la protéine mutée qui est responsable de la maladie de Parkinson. Différentes études comportementales antérieures ont déjà établi que ces souris présentent des altérations motrices de type parkinsonien dès l’âge de 9-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est sévèrement perturbé en amont comme il est maintenant bien décrit chez les patients parkinsoniens. Plusieurs bénéfices importants sont attendus de ce projet de recherche qui visera d’abord à caractériser finement le sommeil de ces souris, de déterminer si elles développent, comme nous le prévoyons, un trouble comportemental en sommeil paradoxal précoce, voire d’autres biomarqueurs potentiels prédictifs de la Maladie de Parkinson, et d’étudier comment la pathologie se propage dans le cerveau au cours du vieillissement. Selon les résultats obtenus, cette souche de souris pourrait alors constituer un modèle préclinique pertinent de la maladie de Parkinson, mimant précisément et chronologiquement son développement au cours du temps. Ceci ouvrirait alors de nombreuses voies de recherche pour la mise au point à moyen terme de traitements préventifs pour ralentir la maladie, voire curatifs en la stoppant complètement dès la pose de son diagnostic.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La moitié des souris (n=12) prévues pour ce projet de recherche subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximum de 60 minutes. Elles seront ensuite mises en isolement lors des phases expérimentales pendant 1 semaine toutes les 2 semaines, soit pour une durée maximale de 18 semaines. Pour le prélèvement des cerveaux en fin d’expérimentation, l’ensemble des souris (n=24) recevront successivement un traitement médicamenteux analgésique puis sédatif avant l’induction par voie intrapéritonéale d’une anesthésie chirurgicale terminale requise pour la perfusion transcardiaque de l’animal.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour l’ensemble des souris (n=24) prévues pour ce projet de recherche, de potentiels effets indésirables liés à l’aspect neurodégénératif du modèle animal sont à considérer et sont de fait attendus (objet du présent projet). Bien que les animaux soient mis à mort avant l’apparition de signes moteurs avant-coureurs de la maladie de Parkinson, il n’est pas à exclure une apparition précoce d’un trouble du comportement en sommeil paradoxal (objectif de ce projet), une perte légère de poids et quelques difficultés locomotrices à l’éveil sur certains individus. Pour la moitié de ces souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), les effets indésirables afférents sont très peu probables mais seront anticipés comme une hypothermie, une hémorragie locale, un arrêt respiratoire ou une infection post-opératoire entraînant une dégradation de l’état de santé. L’isolement des souris durant les phases d’enregistrement pourrait entraîner un léger stress et anxiété transitoire, sans impact sur nos paramètres d’intérêt.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Toutes les souris prévues pour ce projet de recherche (n = 24) seront mises à mort en fin de procédure afin de prélever les cerveaux pour leur étude anatomo-pathologique et comparative.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’intérêt d’étudier les mécanismes physiopathologiques responsables troubles du sommeil réside dans leur caractère prédictif et évolutif vers la Maladie de Parkinson. Or, il est encore aujourd’hui impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade, d’autant qu’aucun marqueur spécifique des mécanismes impliqués n’est encore validé en neuroimagerie. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés sur des biopsies issues de patients mais décédés des décennies après le déclenchement des processus pathologiques. Aussi, des modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire les observations cliniques, les comprendre et les modéliser. La souris est un animal adapté aux études longitudinales (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge). Par ailleurs, les réseaux neuronaux responsables du sommeil sont communs aux mammifères, incluant les rongeurs et l’homme, et sont bien identifiés. Enfin, des animaux de niveau phylogénétique inférieur (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité́/inactivité́) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal qui est spécifique aux mammifères et aux oiseaux (peut-être aux reptiles) et dont la complexité́ du système nerveux n’est en rien comparable avec celle des mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent régulièrement comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles pour aborder des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques sous-jacentes de pathologies évolutives et neurodégénératives comme la Maladie de Parkinson.
2. Réduction
Le nombre d’animaux est légitimé par l’organisation de l’étude autours de deux procédures expérimentales indépendantes mais conduites en parallèle. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos nombreuses études conduites chez la souris et publiées au cours de la dernière décennie par l’équipe, incluant nos travaux déjà réalisés dans le cadre de la demande d’autorisation de projet précédente sur le même sujet. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes des deux procédures expérimentales (chirurgie sous anesthésie générale, récupération post-opératoire, survie post-traitement, comportements anormaux, état de santé général), la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps (procédures de plusieurs mois) pouvant dès lors rendre leur interprétation aléatoire, en enfin la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques paramétriques ou non paramétrique adaptés aux petits échantillons). Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale avec mise à mort pour les analyses des cerveaux, éliminant toute possibilité de réutilisation.
3. Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie de notre centre de recherche, toutes les souris (n=24) seront classiquement hébergées en respectant des conditions optimales à 4 par cage favorisant des interactions sociales normales jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge requis pour les expérimentations. Des enrichissements environnementaux systématiques seront mis en place pour améliorer leur bien-être, tels que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des batônnets de bois à ronger. Pour évaluer le bien-être, le poids et l’état du pelage seront mesurés quotidiennement. Si un animal dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales, il sera retiré́ et euthanasié sans délai. Pour les souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), une attention quotidienne leur sera portée lors de la phase post-opératoire pour optimiser la récupération (ajout d’anti-inflamatoires non-stéroidiens si nécessaire, suivi pondéral, mobilité et comportements) grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Pendant les périodes expérimentales (1 semaine sur 2 pendant 18 semaines), notre préoccupation sera d’analyser régulièrement grâce à des fiches de scorage l’évolution des paramètres physiologiques et le comportement locomoteur pour détecter au plus tôt les perturbations caractéristiques du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Celles-ci constitueront de-facto le point limite des expérimentations, tout en établissant la preuve de concept recherchée. Dans les cas où aucun trouble comportemental en sommeil paradoxal ne se déclencherait avant l’apparition spontanée des signes cliniques moteurs de type parkinsonien (9-10 mois d’âge), la mise à mort sera programmée pour prévenir toute souffrance.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous souhaitons valider un modèle préclinique d’une pathologie neurologique prédictive de la Maladie de Parkinson, en reproduisant chez la souris les mécanismes évolutifs sous-jacents se déroulant sur plusieurs décennies chez les patients, bien avant leur décès. Aussi, les analyses anatomo-pathologiques des cerveaux de patients décédés ne permettent pas d’aborder ces mécanismes qui débutent de façon précoce, bien avant l’apparition des problèmes moteurs bien connus de la Maladie de Parkinson. Il n’existe pas de marqueurs qui permettraient l’exploration fonctionnelle par neuroimagerie. La compréhension de mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par la mise en œuvre de techniques inapplicables chez l’homme mais possible chez la souris présentant de grandes similitudes d’organisation de leur cerveau. Par ailleurs, le sommeil paradoxal est propre aux mammifères. Des modèles d’animaux moins évolués sont parfois utilisés pour l’étude de la vigilance mais ils ne sont pas pertinents pour ce projet. Nos travaux ont permis d’identifier chez le rongeur les structures cérébrales potentiellement ciblées par la pathologie. Ceci rend évident le choix de la souris, particulièrement la souris TgM83 pour induire l’expression de la protéine mutée impliquée dans la pathologie qui nous intéresse. Cette étude longitudinale de la période présymptomatique chez ce modèle murin durera 7 mois environ, débutant chez des souris jeunes adultes asymptomatiques âgées de 3 mois pour s’achever dès qu’apparaitront les premiers signes prédictifs de la maladie de Parkinson (mais avant la mise en place de la pathologie), à l’âge de 9-10 mois. Pour ce type d’étude physiologique et comportementale de longue durée, la souris s’avère à nouveau plus adaptée que le rat (pas de prise de poids et de volume corporel significatif avec le vieillissement, cerveau de plus petite taille avec des processus évolutifs plus rapides) augmentant la faisabilité du projet.