Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/08/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-504755)
8 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une réaction inflammatoire est provoquée par une injection de sensibilisation puis une injection intradermique dans la voûte plantaire, entraînant un œdème douloureux de la patte et des difficultés d’appui. Le porteur indique cinq à sept examens d’imagerie sous anesthésie pour tester des composés contre l’eczéma de contact, la dermatite atopique ou le psoriasis. Toutes les souris sont euthanasiées en fin d’étude, le porteur décrivant l’imagerie sur animal vivant comme le moyen « incontournable » d’évaluer ces composés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’objectif du projet est de reproduire, chez la souris, un modèle d’hypersensibilité retardée survenant chez l’Homme correspondant à une réaction inflammatoire locale aigue, en vue de l’évaluation de composés pour le développement de traitements dans des pathologies inflammatoires de la peau. Le modèle de réponse d’hypersensibilité retardée est utilisé de manière standard en Immunologie car il permet d’évaluer la réponse immunitaire à l’injection ou au contact d’une molécule identifiée comme corps étranger par l’organisme. Ce modèle permet ainsi d’évaluer l’impact thérapeutique de composés permettant de réduire la réaction immunitaire inflammatoire consécutive à une seconde exposition avec ce même antigène. L’approche envisagée n’est pas spécifique d’une pathologie donnée mais plus tôt des voies mécanistiques conduisant à des pathologies liées à l’exacerbation de l’immunité locale chez le patient. Ce projet permet de caractériser les modifications de la réponse immunitaire induite par les composés testés. Il permet de caractériser leur cinétique de distribution et d’élimination dans l’organisme étudié (la souris), la cinétique d’action et l’efficacité de ces mêmes composés par imagerie non invasive, en vue de la sélection de candidats médicaments pour préparer leur évaluation chez l’Homme en clinique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. A court terme ce projet permet d’identifier le potentiel thérapeutique de molécules ciblant la réaction inflammatoire locale aigüe en vue de développements de traitements dans l’eczéma de contact (crèmes métaux polluants), la dermatite atopique, le psoriasis arthritique… L’approche par imagerie permet de suivre les paramètres de distribution, d’élimination ; le mécanisme d’action du composé sur l’inhibition du système immunitaire et d’évaluer l’efficacité du traitement contre la réaction inflammatoire produite en permettant une investigation de plusieurs paramètres simultanés de façon non invasive et longitudinale sur les mêmes animaux. L’approche permet donc ainsi de diminuer le nombre d’animaux testés par rapport à une approche conventionnelle nécessitant des prélèvements de tissus répétés pour obtenir des informations équivalentes. A plus long terme, les données générées sur ce modèle permettront d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus immunologiques impliqués dans diverses pathologies inflammatoires humaines et feront l’objet de publications seront partagés avec la communauté scientifique. Les données générées permettront de sélectionner des composés et supporter leur évaluation en phase clinique pour contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché de ces nouveaux médicaments. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables dans le diagnostic ou le suivi de pathologies inflammatoires chroniques ou un bénéfice/risque serait plus envisageable (Arthrites, syndrome de l’intestin irritable, maladie de Crohn…).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Chaque animal reçoit deux injections de la molécule induisant la réponse inflammatoire. (Une première injection, dite de sensibilisation, à la molécule inflammatoire (antigène) complexée à un adjuvant est pratiquée dans la zone dorsale par voie sous cutanée. Cinq jours après, une injection intradermique de l’agent inflammatoire seul est pratiquée sous anesthésie dans la voute plantaire d’une patte postérieure. Les composés évalués pour leurs activité anti-inflammatoire dans le modèle, sont administrés par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale, ou sous cutanée ou par voie orale. Les animaux sont injectés avec les agents de contraste d’imagerie par voie intraveineuse, ou intrapéritonéale ou sous-cutanée, et sont soumis aux examens d’imagerie.Chaque administration/injection de composé est réalisée environ en 1 minute. Ils sont anesthésiés à chaque prise d’image (5 à 7 examens d’imagerie par étude espacés sur 10 jours). Chaque prise d’image dure de 1 à 10 minutes maximum en fonction de la modalité d’imagerie mise en œuvre (nucléaire ou optique), et en fonction de la nature du traceur employé. Le volume de l’inflammation de la patte injectée sera mesuré au pied à coulisse sous anesthésie tout au long de l’étude. (Compter 1 minute pour la mesure). La durée de l’anesthésie est de 5 à 15 minutes en anesthésie gazeuse pour chaque prise de vue, de façon à permettre l’installation de l’animal dans l’appareil sous le champ de la caméra, la prise de vue et la mesure de l’œdème.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La première injection d’induction de sensibilisation à l’antigène permet de sensibiliser le système immunitaire de la souris pour lui permettre de reconnaitre la molécule étrangère. Le complexe étant visqueux l’injection sous-cutanée s’effectue en deux points sous anesthésie gazeuse pour limiter les effets de volume et l’irritation. Cinq jours après, l’injection du même antigène que celui utilisé pour la sensibilisation (sans adjuvant) est pratiquée par voie intradermique dans la voute plantaire d’une des pattes postérieures, sous anesthésie gazeuse. L’antigène sera reconnu par le système immunitaire de la souris sensibilisée qui réagira en développant une réaction inflammatoire jusqu’à l’apparition d’un œdème au site de la seconde injection dans les 24 heures. La phase aigüe de l’inflammation est maximale à 24h, elle se traduit par un gonflement et une rougeur du pied qui diminue spontanément dans le temps. L’inflammation génère une certaine douleur qui peut conduire à des difficultés d’appuis ou de locomotion de façon transitoire. Les injections de produits testés ou d’agents d’imagerie, ainsi que et des prélèvements sanguins répétés peuvent provoquer un inconfort léger à modéré et de courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris sont euthanasiées en fin d’étude. Le sang et organes d’intérêt peuvent être prélevés pour analyses. Si les points limites sont atteints en cours d’étude, les souris sont euthanasiées pour raison éthique de façon anticipée.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les études d’imagerie permettent de documenter le devenir du composé testé dans le corps d’un animal vivant et de valider les propriétés thérapeutiques des composés à l’échelle du corps entier, pour préparer le protocole d’évaluation des composés sélectionnés dans les phases cliniques en vue de l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau traitement chez l’homme. Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe car, aucune méthode substitutive fiable d’évaluation in vitro ou in silico d’une molécule ne permet de répondre à toutes les interactions in vivo.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Ensuite, sur la base des données historiques expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétitions), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés, de la modalité d’imagerie mise en œuvre, et de l’importance des effets à mettre en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. Les techniques d’imagerie permettent l’étude longitudinale des paramètres reflétant l’impact du produit testé sur la réponse inflammatoire induite pour chaque animal, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études par rapport aux études traditionnelles.
3. Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe de 4 à 5 par cage et un enrichissement spécifique est donné aux souris : un abri en carton, une litière en cellulose standardisée et douce type « Alpha dri ® » est utilisée pour faciliter la locomotion, de la nourriture et un gel hydratant sont apportés en supplément directement dans la cage dès le démarrage de l’étude. – Les anesthésies gazeuses sont employées : lors des injections sous cutanées du complexe antigène/ adjuvant (2 x 50µl en sous cutané) pour tenir compte de la viscosité importante du complexe, lors des injections intradermiques dans la voute plantaire, lors de la mesure de l’œdème inflammatoire au pied à coulisse permettant de limiter la douleur générée par la pression exercée sur le site inflammé. – Les sessions d’imagerie s’effectuent sous anesthésie gazeuse (ou fixe) pour garder l’animal immobile et sans stress le temps de la prise d’image. Les autres examens complémentaires sont réalisés juste avant ou immédiatement à la suite des prises d’images pour bénéficier de cette anesthésie. Après chaque anesthésie, Les animaux sont suivis jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou chauffé à 23°C pour optimiser les conditions de réveil. – Le recours à l’imagerie pour l’évaluation de la bio distribution des composés testés et l’évaluation de l’impact du traitement sur la réponse inflammatoire à l’aide de biomarqueurs d’imagerie constituent un raffinement en soi puisqu’il permet de générer des informations spécifiques de la réponse au traitement de façon non invasive tout au long de l’étude, de façon répétée sur les mêmes animaux, en limitant le recours à des prélèvements de tissus à intervalles réguliers nécessaires sans cela. – A ce jour, le modèle de référence est le modèle proposé. Selon les résultats obtenus, on pourra ensuite tenter de raffiner le modèle en utilisant des adjuvants moins réactifs ou une autre voie d’injection pour atténuer les effets secondaires, mais en conservant la réponse immunitaire équivalente dans son mécanisme d’action. L’apparition de trois signes cliniques notables (dos vouté, déshydratation, blessure, abcédation au point d’injection dorsale, stéréotypies, pelade…), ou d’un seul signe clinique sévère (perte de poids ≥ 20%, ou ≥ 15% 3 jours de suite, automutilation, plaie, infection, nécrose) entraine l’arrêt anticipé de tout ou partie de l’étude en accord avec le directeur d’étude et le vétérinaire responsable.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle d’hypersensibilité retardée chez la souris est documenté et décrit dans la littérature est standardisé et largement utilisé. Ce modèle fait appel à une réponse cellulaire inflammatoire cutanée dont le mécanisme est comparable à celle qui se développe chez l’Homme au contact d’agents inflammatoires. Par ailleurs, la facilité d’utilisation, la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives nucléaires et optiques, la compatibilité avec l’étude des composés sur des effectifs relevant d’un point de vue statistique, la disponibilité des modèles humanisés exprimant les cibles thérapeutiques d’intérêt, et de souris transgéniques exprimant un reporteur d’imagerie d’intérêt, et la faible variabilité de réponse attendue d’un animal à l’autre par rapport à d’autres espèces permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets plus robustes et reproductibles sont autant d’avantages qui nous ont conduit à choisir la souris comme modèle. Les souris adultes sont utilisées dans ce projet pour mimer la pathologie chez les patients adultes car l’immunité varie fortement en fonction de l’âge.