Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/02/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-510232)
462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 408 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les mâles porteurs de la mutation développent une faiblesse musculaire généralisée et une forte mortalité vers deux mois, avant de recevoir des injections censées corriger le gène de la myopathie myotubulaire. Les souris subissent des mesures de force musculaire et des prélèvements sous anesthésie, et les portées non utilisées sont tuées au sevrage. Le porteur affirme que le recours à l’animal est « indispensable » car aucun modèle cellulaire ne mesure la perte de force.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Il n’existe actuellement aucun traitement pour la myopathie myotubulaire, une maladie congénitale très sévère affectant les muscles squelettiques. Cette pathologie affecte presque exclusivement les garçons et entraine dans la majorité des cas la mort prématurée du patient avant l’âge d’un an. La myopathie myotubulaire est causée par des mutations dans le gène MTM1 qui code pour la myotubularine MTM1, une protéine qui modifie certains phospholipides membranaires. Sa déficience implique une désorganisation, une hypotrophie, et une faiblesse musculaire généralisée qui entraîne une sévère faiblesse respiratoire nécessitant une assistance mécanique. Un essai clinique est actuellement en cours (NCT03199469 ASPIRO). Dans cet essai, un vecteur de type AAV (dérivé de virus associés à l’adénovirus) est injecté par voie intraveineuse pour permettre d’introduire le gène humain MTM1 dans les muscles des patients. Ce produit avait été testé au préalable dans des souris Mtm1-KO BS53d4-PAS (fond génétique 129/svPas) déficientes en myotubularine dans tous les tissus de l’organisme, ainsi que dans un modèle canin de la myopathie myotubulaire. Chez ces modèles animaux de la maladie, le traitement par thérapie génique a permis d’obtenir une restauration du phénotype. Cependant, il est actuellement impossible de déterminer si l’efficacité du vecteur de thérapie génique sera suffisamment durable pour couvrir toute la vie du patient. De plus, pour des raisons de réponse immunitaire, il n’est actuellement pas possible de réaliser une deuxième injection du vecteur de thérapie génique pour ajuster une potentielle diminution de l’effet thérapeutique. Ainsi, le but de ce projet est de proposer une thérapie génique alternative permettant de corriger directement le gène Mtm1, et a fortiori de restaurer le phénotype de manière permanente. La première procédure nous permettra maintenir la lignée de souris, et obtenir les animaux qui seront inclus dans les autres procédures. La deuxième procédure consiste à un criblage des candidats à traiter la myopathie myotubulaire, réalisé dans un muscle spécifique des pattes postérieures. Cela nous permettra de sélectionner les traitements les plus efficaces. La troisième procédure est une analyse approfondie des meilleures candidates de la procédure numéro 2, qui permettra vérifier qu’ils sont capables de guérir la myopathie myotubulaire à niveau systémique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Dû à l’absence d’expression de la myotubularine, les souris Mtm1-KO BS53d4-PAS mâles présentent une faiblesse musculaire généralisée, une hypotrophie, une perte de poids et une forte mortalité á l’âge de deux mois. Au niveau histologique, ce modèle murin présente de petites fibres musculaires et une forte centronucléation dans ces myofibres. L’efficacité des thérapies de ce projet sera analysée par une amélioration de tous ces critères.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Mesure de la force musculaire in situ du muscle Tibialis anterior, sur animaux vivants anesthésies : environ 1h15 par souris. Prélèvements des TA droits et gauches et des Gastrocnemius droits et gauches sur animaux vivants anesthésies : prélèvements uniques, environ 1 heure 15 par souris.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles hémizygotes développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les traitements visant à guérir la maladie seront appliqués par injections intramusculaires (susceptibles de provoquer une douleur modérée) ou intraveineuses (qui provoquent une douleur légère). Pour empêcher les animaux de souffrir pendant les injections intramusculaires ou pendant les mesures de force musculaire, nous réaliserons des injections des analgésiques et anesthésiques par voie intra cutanée et/ou intrapéritonéale, ce qui provoquera une douleur légère.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les souris qui seront nées dans le contexte de cette étude, et qui ne seront utilisées pour évaluer les traitements prévus, seront euthanasies au sevrage. Les animaux traités avec les produits conçus pour guérir la myopathie myotubulaire seront euthanasiés en fin de procédure pour pouvoir réaliser les analyses histologiques et biochimiques qui nous permettront de connaître l’effet des thérapies dans les muscles.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible). A l’opposé, le modèle de souris qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des tissus.
2. Réduction
Les femelles hétérozygotes issues des croisements pour obtenir les males malades nécessaires pour ce projet seront utilisées pour le maintien de la lignée. Le juste nombre de souris nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions a été estimé à douze souris par groupe par une étude statistique prédictive (test de comparaison des moyennes). Les souris seront élevées et la lignée sera entretenue dans notre établissement utilisateur. Notre projet durera 3 ans et nécessitera l’utilisation totale de 462 souris. La procédure expérimentale numéro 2 nous permettra d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements candidats à améliorer le phénotype de la myopathie myotubulaire, et la procédure numéro 3 nous permettra de voir les effets d’une administration systémique globale chez la souris, et d’évaluer les effets dans l’ensemble de l’organisme de l’animal. S’il s’avère qu’aucun des traitements n’améliore le phénotype de la maladie dans la procédure expérimentale numéro 2, la procédure expérimentale numéro 3 ne sera pas exécutée. Nous avons aussi décidé, dans la procédure expérimentale numéro 3, de réduire à deux temps d’analyse l’effet des traitements injectes de façon systémique, à court terme (1 mois post injection), et à moyen terme (3 mois post injection). Néanmoins, si nous ne vérifions pas une amélioration du phénotype des souris dans l’étude à 1 mois, l’étude à 3 mois ne sera pas effectuée.
3. Raffinement
Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton dans un environnement exempt d’organisme pathogène. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades et aux animaux contrôles WT. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Les injections intramusculaires et les prélèvements de muscles pour les tests de mesure de force seront pratiqués sous anesthésie générale. Pour le semi-isolement du muscle Tibialis Anterior, l’anesthésie des animaux sera précédée d’une injection de Buprecare.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les souris Mtm1-KO BS53d4-PAS ont été choisies comme animaux modèles pour trois raisons : 1) Ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène Mtm1, responsable de la myopathie myotubulaire. 2) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. 3) Ces souris sont le modèle du petit animal le mieux caractérisé : elles reproduisent avec fidélité les signes cliniques (faiblesse musculaire et respiratoire) et moléculaires (centronucléation, hypotrophie des myofibres, dysfonctionnement du couplage excitation nerveuse-contraction musculaire…) caractéristiques de la maladie humaine. Les souris mâles BS53d4-PAS WT et les femelles Mtm1-KO BS53d4-PAS hétérozygotes pour la mutation sur le gène Mtm1 seront mises en reproduction entre l’âge de 6 semaines et de 1 an, ou seront euthanasiés si les accouplements ne marchent plus ou si les points limites sont atteints. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les souris Mtm1-KO BS53d4-PAS mâles hémizygotes. Notre étude vise à corriger les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés après l’apparition des symptômes, en s’assurant que les points limites ne soient pas atteints.