Impacts directs et multigénérationnels d’obésogènes et de perturbateurs métaboliques sur le xénope tropicalis (Silurana xenopus tropicalis)

Des études récentes suggèrent que les effets métaboliques transgénérationnels induits par les perturbateurs endocriniens (PE) sont des facteurs impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant leur capacité à se reproduire. Cependant, plusieurs questions se posent : Comment les PE agissent chez les amphibiens ? Quelles sont leurs effets sur les autres axes endocriniens ? Quel parent transmet l’effet à la descendance ? Quels sont les mécanismes responsables de la transmission des effets sur plusieurs générations ? Ce projet répondra à ces questions en étudiant les effets d’une mixture de 6 PE à concentrations environnementales sur 3 générations de X. tropicalis (F0 directement exposée, F1/F2 non exposées). Les effets seront évalués à chaque génération par l’étude du développement, des effets reproducteurs, thyroïdiens et neuro-développementaux, des perturbations métaboliques et de la transmission des effets entre générations.

D’un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de la transmission des effets au cours des générations et de l’écotoxicologie. Les informations sur l’impact transgénérationnel des PE chez les vertébrés font défaut et les méthodologies d’exposition des animaux à de faibles concentrations de polluants tout au long de leur vie doivent être testées. Ce projet permettra de comprendre quel sexe transmet les effets des PE à la descendance. D’un point global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Les amphibiens représentent une proportion élevée de la diversité des espèces mondiales et sont largement répandus. Plusieurs études ont démontré que plus la biodiversité des amphibiens est grande dans les zones humides, plus l’écosystème est protégé contre les maladies, y compris celles qui touchent les humains. En fournissant des résultats sur les effets transgénérationnels métaboliques des PE, les données obtenues peuvent être appliquées non seulement aux amphibiens mais aussi aux vertébrés supérieurs, y compris les humains. Comme le modèle xénope partage de nombreuses voies métaboliques avec l’homme, il est de fait un bon prédicteur des effets des PE chez l’homme. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l’évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l’environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes. Un objectif important est d’identifier des biomarqueurs précoces potentiels de perturbations métaboliques qui seront applicables à différentes espèces d’amphibiens vivant dans des écosystèmes pollués. La recherche proposée soutiendra l’élaboration de politiques et de lignes directrices qui guideront la conservation des populations d’amphibiens et la gestion des PE.

Les xénopes de la génération F0 seront exposés à un mélange de perturbateurs endocriniens (tributylétain, di-2-éthylhexyl phthalate, polybromodiphényle éther 47, triclosan, benzo[a]pyrene, et 4,4’-dichlorodiphényldichloroéthylène) du stade têtard (stade 10 de Nieuwkoop et Faber) au stade adulte pendant une génération (F0) (~10 mois). Au total 1500 têtards seront exposés aux PE et 1500 serviront de contrôles. Pour les tests de tolérance au glucose et de résistance à l’insuline, des injections sont effectuées sur animaux vigiles dans le ventre (intrapéritonéale) ou dans les sacs lymphatiques dorsaux. A la suite de ces injections des dosages de glycémie sont effectués par prélèvements digitaux toutes les heures pendant 6 heures (2 lots d’animaux, exposés et témoins, pour la génération F0 et 4 lots pour les générations F1 et F2 soit un total de 400 animaux (80 F0, 160 F1 et 160 F2). Pour les tests de sécrétion d’insuline, les xénopes subissent une injection intrapéritonéale de glucose à T0 et sont euthanasiés 30 minutes après. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests de de sécrétion d’insuline après injection de glucose à chaque génération soit un total de 200 animaux (40 F0, 80 F1 et 80 F2). Pour les tests immunitaires, les animaux reçoivent une injection de phytohémagglutine A dans la jambe droite (50 µl à 2 mg/ml) et de solution saline (50 µl de PBS dans la jambe gauche). A T0 et T12heures, le diamètre de chaque jambe est mesuré et un prélèvement digital est réalisé pour faire un frottis sanguin. Cette opération est répétée 7 jours après pour évaluer la mémoire immunitaire. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests. Pour la fécondation in vitro, les animaux reçoivent deux injections dans les sacs lymphatiques dorsaux d’hCG à 20 heures d’intervalle. A la suite de la seconde injection, les femelles sont laissées tranquilles dans des aquariums pour attendre la ponte qui se fait de manière naturelle environ deux heures après. Les mâles sont euthanasiés deux heures après la deuxième stimulation. Les femelles sont euthanasiées à la fin de la période de ponte. 15 mâles et 15 femelles par condition (traités et non traités pour F0 et les 4 conditions issues des 4 modalités d’accouplement pour F1 et F2) seront utilisés à chaque génération pour les accouplements en vue d’obtenir la génération suivante. Le nombre total d’animaux sera de 300 (60 pour F0, 120 pour F1 et 120 pour F2).

Les concentrations utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Elles ne sont pas senser induire de souffrance chez les animaux. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations mais il n’est pas possible d’évaluer le degré de souffrance engendré par l’exposition. Les prises de sang digitales pour les tests de tolérances au glucose ou de résistance à l’insuline et les injections intrapéritonéales de glucose ou d’insuline dans les sacs lymphatiques sont susceptibles d’entrainer des douleurs légères. Au stade têtard des déformations de la colonne vertébrale sont décrite comme pouvant survenir lors d’un stress.

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d’organes ou des tests métaboliques.

Le choix de l’espèce xénope tropicalis est justifiée par deux raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (~10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet des polluants sur plusieurs générations et 2) c’est une espèce dont le génome est entièrement séquencé et diploïde permettant ainsi des études transcriptomiques ou épigénétiques. C’est un modèle dont nous maitrisons l’élevage au laboratoire (certificat de capacité obtenu) et pour lequel nous avons déjà réalisé des études multigénérationnelles. Les animaux seront utilisés du stade gastrula au stade adulte mature sexuellement. Les PE agissent sur de nombreuses cibles au stade larvaire et durant tout le cycle de développement jusqu’au stade adulte mature sexuellement. Il est donc important de regarder les impacts de ces polluants à différents stades du développement des animaux.