Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 02/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-585335)
10 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l’ablation des ovaires avec pose d’un implant d’œstradiol, puis une injection de colchicine directement dans le cerveau, pour identifier les neurones impliqués dans le déclenchement de l’ovulation. Le porteur indique que la colchicine peut provoquer diarrhée et douleurs abdominales, les souris étant mises à mort vingt-quatre à vingt-sept heures après l’injection, avant l’apparition de ces effets, pour prélever leur cerveau. Il affirme que la reproduction « ne peut s’observer » que sur un organisme entier et renonce à toute analyse statistique, l’objectif déclaré étant de pouvoir publier des données descriptives.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les mammifères présentent soit une ovulation spontanée soit une ovulation induite. L’ovulation dépend de la sécrétion de deux hormones la gonadolibérine ou GnRH et l’hormone lutéinisante ou LH. Les mécanismes permettant la sécrétion de la GnRH et de la LH sont encore mal connus. Chez les espèces à ovulation induite, un facteur de croissance (βNGF) semble être une molécule clé dans le déclenchement de l’ovulation, rôle qui semble tenu dans les espèces à ovulation spontanée par un autre neurotransmetteur, la kisspeptine. Nos données suggèrent l’implication du facteur de croissance aussi pour induire l’ovulation chez les espèces à ovulation spontanée via une action sur la sécrétion de la kisspeptine. Nous souhaitons établir si cette action est directe ou indirecte. Cette information est essentielle pour pouvoir publier nos données. Nous envisageons de réaliser des marquages multiples pour détecter la kisspeptine et le récepteur du facteur de croissance. Les données obtenues permettront de déterminer si le récepteur est exprimé ou non sur les cellules à kisspeptine. Dans le cas où il n’y aurait pas de co-localisation entre la kisspeptine et le récepteur, nous établirons la possibilité d’une action indirecte via des neurones à catécholamines. Nous allons donc utiliser des souris femelles et des marquages multiples pour vérifier ces hypothèses.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La réalisation de ce projet nous permettra de comprendre si les mécanismes qui déclenche l’ovulation après la stimulation avec le βNGF comportent une stimulation directe des neurones à kisspeptine ou nécessitent d’un interneurone. Cette information nous permettra de vérifier si du point vu évolutive les mécanismes d’induction de l’ovulation sont conservés entre ovulations induites et spontanées. Ceci représente une information très importante pour la compréhension de l’évolution des modalités d’ovulation chez les mammifères.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis a des procédures chirururgicales pour enlever les ovaires et positionner un implant sous-cutanée d’oestradiol. Cette procedure durera environ 15 minutes. Entre 7 et 10 jours plus tard les animaux seront soumis à une deuxième intervention pour réaliser une injection intracerebroventriculaire de colchicine. Cette procédure aussi aura une durée d’environ 15 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’ovariectomie avec implant d’oestradiol est une technique largement utilisée dans les recherches en neuroendocrinologie de la reproduction et des douleurs peropératoires au site d’opération et de suture sont envisagées. Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies, ainsi qu’une douleur localisée en post-opératoire au niveau du site d’incision de la peau du crâne. Les effets indirects peuvent découler de la chirurgie (trouble comportemental, baisse d’activité locomotrice) et du produit injecté (diarrhée). Les effets directs sont de courte durée (de quelques heures à quelques jours). Les effets indirects peuvent survenir après quelques heures mais se poursuivre sur plusieurs jours. L’administration de colchicine sera effectuée par injection intracerebroventriculaire. L’injection de colchicine peut induire des effets indésirables tel que la diarrhée, des douleurs abdominales, des troubles du système nerveux. L’euthanasie des animaux sera effectuée dans les 24-27 heures après l’injection de colchicine et donc préalablement à la manifestation de ces effets.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans la première partie de l’expérience toutes les souris (10) seront soumis aux chirugies indiquées dans le protocole détaillé. Par la suite toutes les souris (10) seront euthanasiées pour prélever le cerveau et rélaiser l’immunocytochimie.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La fonction de reproduction étant une fonction intégrée (sous influence de facteurs environnementaux et hormonaux endogènes) contrôlée par l’hypothalamus, elle ne peut s’observer que sur des organes entiers provenant d’un organisme vivant. Nous ne pouvons donc pas remplacer l’utilisation d’animaux pour notre expérience.
2. Réduction
Notre étude ce base sur l’analyse des données descriptives : coexistence ou non de marquage et éventuelle pourcentage de cellules marques par rapport à l’ensemble de la population. Nous n’avons donc pas besoin de réaliser des analyses statistiques pour cette expérience. Le choix du nombre d’individus par lot s’appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure. Les souris utilisées seront ovariectomisées. Les ovaires produisent les hormones stéroïdes qui rétroagissent au niveau cérébral pour moduler le cycle ovarien. Ces hormones présentent des fluctuations endogènes de leurs taux au cours du cycle, l’ovariectomie (suivie d’un traitement substitutif : implant d’estradiol) va permettre de standardiser les taux endogènes circulants et donc de réduire l’effectif d’animaux à inclure dans l’expérimentation. Pour établir le nombre d’animaux à utiliser nous avons prix en considération le fait que les animaux seront soumis à deux chirurgies, à une perfusion intracardiaque et aux aléas de la coupe après congélation. Nous estimons que pour pouvoir obtenir 6-7 échantillons exploitables de la région d’intérêt, nombre que nous permettra d’avoir des données solides, nous devons partir d’un groupe de 10 animaux. L’utilisation d’un nombre moindre d’animaux pourrait être suffisant, mais vu le risque d’avoir à répéter l’expérience, suite aux aléas liés aux différentes manipulations, et donc augmenter ultérieurement le nombre de souris, ce choix nous semble le plus pertinent pour réduire aux minimum le nombre de souris utilisées.
3. Raffinement
Les souris seront hébergées par trois ou cinq par cage en présence d’objets en carton (boites à œufs, frisottis en papier). Une semaine d’ habituation à la manipulation par l’expérimentateur est prévue pour réduire le stress lors des différentes manipulations prévues par le protocole. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les yeux de l’animal seront protégés au moyen d’une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris est l’espèce de référence utilisée en routine par de nombreux laboratoires est aussi l’espèce sur la quelle nous avons obtenu les résultats d’induction de l’ovulation avec le beta-NGF. Pour étudier l’ovulation nous avons besoin de souris femelles adultes.