Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 08/11/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-595769)
72 souris knockout vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour des analyses physiologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des prélèvements de sang par incision du bout de la queue et une exposition au froid à 10 puis 4 °C, un groupe étant exposé à 4 °C sans nourriture. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer une baisse de la température corporelle et une perte de poids, et que l’isolement en cage individuelle représente un facteur de stress. Sur le remplacement, il affirme qu’il n’existe pas de « système cellulaire pertinent » pour étudier ces deux gènes exprimés dans le cerveau, un nouveau modèle préclinique de la maladie étant renvoyé au long terme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons aborder les conséquences physiologiques de la perte de fonctions deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle d’étude (souris knockout,KO). Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l’humain, des données cliniques montrent que des anomalies dans l’expression de ces gènes sont liées à une maladie rare, associée à des troubles métaboliques. Comprendre la fonction de ces gènes, très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel et devrait contribuer à améliorer notre compréhension de l’étiologie de la pathologie. A ce jour, il n’existe pas de système cellulaire pertinent permettant d’aborder leurs fonctions. Plus précisément, nous souhaitons tester si l’invalidation de ces gènes que nous étudions influence de potentielles perturbations du métabolisme qui sont caractéristiques de la pathologie chez l’humain.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Notre programme de recherche vise à combiner génétique inverse et exploration phénotypique pour parfaire notre compréhension de l’importance physiologique de ces deux gènes d’interêt. De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression de l’un deux, et aussi probablement de l’autre, joue un rôle déterminant dans la physiopathologie du syndrome. Cette maladie rare s’accompagne de nombreuses altérations dont métaboliques. Un trait saillant de ce syndrome est une hyperphagie obsessionnelle accompagnée par une baisse de la dépense énergétique qui, le plus souvent, se traduit par une obésité morbide. Comprendre la fonction de ces gènes très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel. A court terme, ce travail permettra de mieux définir la contribution des ces gènes dans le contrôle du métabolisme. A plus long terme, notre souris knockout pourrait représenter un nouveau modèle pré-clinique de la maladie.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédure 1 (N=24 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l’extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes). Ils seront réalisés une seule fois durant cette procédure. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d’un glucomètre et sur une bandelette d’un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres. Procédure 2 (N=48 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l’extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes) seront réalisés à T0h, T11h et T24h. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d’un glucomètre et sur une bandelette d’un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres (uniquement à T0h et T24h).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Pour la procédure 1 et 2, les animaux sont individualisés dans des cages, cela peut représenter un facteur de stress durant les premières heures d’isolement. Les deux procédures expérimentales consistent à challenger le métabolisme des souris en les exposants au froid (10°C ou 4°C). Une des nuissances attendues est la diminution de la température corporelle. Pour la procédure 2, un groupe de souris par génotype (WT et KO) est exposé au froid (4°C) sans nourriture. Les nuissances attendues sont la perte de poids et la diminution de la température corporelle. Pour les deux procédures expérimenatles une douleur est occasionnée lors des prélèvements de sang par incision du bout de queue.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de chaque procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (soit 72 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations physiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous comptons explorer la fonction biologique de ces deux gènes d’interêt. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau. Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder la fonction de ces derniers, notamment leurs rôles dans le contrôle du métabolisme.
2. Réduction
L’équipe avec laquelle nous collaborons, dispose d’un recul important concernant le nombre d’animaux à utilisés. Compte tenu de la variabilité des profils métaboliques observée au sein d’un groupe d’animaux, 12 animaux par groupe suffiront pour ces tests afin de réaliser des statistiques fiables sur nos résultats.
3. Raffinement
Les animaux sont placés en salle d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place des carrés de ouate dans les cages pour amoindrir le stress du transport. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 3 fois par semaine (2 changes par les zootechniciens, 1 fois par les expérimentateurs). Des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance lors des observations quotidiennes tels que des blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l’on vient attraper l’animal), maigreur (une perte de poids >20%), problème de dentition ou une altération de l’état du pelage conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Tous les modèles animaux de cette maladie génétique décrits à ce jour sont réalisés chez la souris. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.