Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-631992)
840 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un gavage quotidien d’antibiotiques pendant vingt-huit à cinquante-six jours pour détruire leur microbiote intestinal, un hébergement individuel, des prises de sang mensuelles et un test d’activité, avant une ponction du cœur sous anesthésie. Le porteur décrit une dysbiose provoquant constipation, perte de poids, troubles cognitifs et anxiété, aggravée par un isolement qu’il reconnaît lui-même comme source d’anxiété. Il teste pour un partenaire privé un composé à base de Queuine contre les maladies neurodégénératives, et affirme le modèle in vivo nécessaire là où l’in vitro ne suffit pas.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Actuellement, de nombreuses preuves tendent à indiquer qu’une défaillance du microbiome intestinal altérerait le fonctionnement du système nerveux central et pourrait être liée à l’origine de pathologies neurodégénératives les plus répandues dans le monde telles que les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Les bactéries présentes dans la flore intestinale jouent un rôle important dans la production de plusieurs molécules essentielles dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme. En effet, une fois synthétisées au sein du microbiote, ces molécules sont ensuite distribuées vers plusieurs organes tels que le cerveau. Ces observations ont donc mis en évidence des voies de communication entre les intestins et le cerveau. Parmi ces molécules, la Queuine, une base azotée uniquement synthétisée par le microbiote intestinal et/ou fournie par l’alimentation, jouerait un rôle prépondérant dans l’apparition de pathologies du système nerveux central (SNC). Afin d’étudier l’effet de molécules telles que la Queuine sur le SNC, ce projet a pour objectif de tester l’efficacité d’un composé à base de Queuine ou d’autres molécules similaires sur un modèle in vivo de dysbiose chez la souris C57Bl6 également soumises à une alimentation spécifique. Pour cela, les souris suivront une antibiothérapie quotidienne, par voie orale, visant à détruire le microbiote intestinal qui sera associé à un régime alimentaire spécifique sur une durée de 1 ou 2 mois. Une partie de ces souris seront administrée par voie orale avec un composée supplémenté en Queuine ou autres molécules. Les souris subiront une analyse comportementale à partir du test de l’open field (OFT) mesurant l’activité locomotrice spontanée et estimant indirectement les comportements associés à l’anxiété. Des prélèvements de sang mensuels et terminaux seront effectués pour mesurer la biodisponibilité des molécules d’intérêts libérées par le microbiote intestinal et/ou des candidats médicaments dans le plasma. De même, la présence de bactéries sera contrôlée suite à des prélèvements mensuels de fèces afin d’évaluer l’efficacité de l’antibiothérapie sur la destruction du microbiote intestinal. À la fin du protocole, après une ponction intracardiaque de sang, ces mêmes souris subiront un prélèvement de l’intestin, du foie et de l’encéphale afin de comparer les effets du candidat médicament sur les caractéristiques histologiques et moléculaires principales de la dysbiose et de certaines pathologies neurodégénératives.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de la dysbiose sur le SNC et notamment le rôle joué par la Queuine, molécule issue du microbiote intestinal et/ou de l’alimentation, sur 1) les troubles de la locomation et des troubles associés à l’anxiété 2) sur les caractéristiques cérébrales histologiques et moléculaires associées à certaines maladies neurodégénératives. Ce projet permet également de tester l’efficacité d’un candidat médicament sur les troubles du comportement associés à la dysbiose, et sur les caractérisques histologiques et moléculaires de plusieurs organes.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des souris mâles (âge : 15 semaines) sont soumises à une administration quotidienne sur 28 ou 56 jours, par gavage oral, d’un mix de 4 antibiotiques et d’1 antifongique solubilisés dans l’eau stérile afin d’induire une dysbiose intestinale (durée de l’acte de gavage : 1min/souris). Pour certains de ces animaux, le composé médicament, mélangé avec la solution contenant l’antibiothérapie, est également administré quotidiennement par gavage durant 28 jours. Après le début de l’antibiotérapie, les souris sont disposées de manière individuelle par cage pour la reste du protocole (i.e., 28 ou 56 jours). La seconde intervention consiste à des prélèvements de sang (50-100 μl) mensuels (environs 1-2min/souris) sur souris vigiles au niveau de la veine submandibulaire (à J0 uniquement et/ou à J28 selon le groupe expérimental) ainsi qu’à des prélèvements de fèces mensuels (à J0, J28 et J56 selon le groupe expérimental) pour lequel les souris sont placées dans une cage propre durant une courte durée (environs 20 min). La 3ème intervention consiste à effectuer l’évaluation comportementale des souris, mesurant l’activité locomotrice spontanée et les comportements associés à de l’anxiété à partir du test de l’open field à J28 et J56 (durée d’intervention : 20min environ). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 4% mix air et oxygène) avant la mise à mort des animaux (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 10min).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Un des effets indésirables potentiel est lié à l’administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’antibiothérapie permettant d’induire la destruction de la flore intestinale ainsi que l’administration quotidienne du composé se réalisent par gavage oral et peuvent générer du stress et des dommages au niveau du tube digestif. Par ailleurs, la dysbiose provoque un ralentissement de la prise de poids mais également ralentis les mécanismes moteurs de la digestion induisant ainsi de la constipation. L’antibiothérapie prolongée est également associée à des troubles cognitifs et de l’humeur et est source d’anxiété. L’isolement des souris est également une source importante d’anxiété. La perte de poids s’occasionne surtout durant les 4-5 premiers jours après le début de l’antibiothérapie. Cette dernière peut également conduire à la diminution de l’efficacité du système immunitaire augmentant les risques d’infections. Tout au long du protocole, les animaux sont mensuellement soumis à des prélèvements sanguins par ponction au niveau de la veine submandibulaire pouvant provoquer un écoulement sanguin persistant après le prélèvement. De plus, à la suite du prélèvement sanguin, les animaux sont isolés dans une cage propre durant 15 à 20 min afin de pouvoir récolter les fèces ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress. En fin de protocole, l’animal est de nouveau anesthésié afin de subir un prélèvement sanguin intracardiaque avant d’être mise à mort pour récupérer le cerveau, les intestins et le foie.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour tous les animaux de la procédure, le protocole se termine par un prélèvement de sang terminal par ponction intracardiaque (1ml) sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% induction et maintien) soit à J28 soit à J56 entrainant la mort par exsanguination suivi par une dislocation cervicale pour confirmer la mort afin de prélever les organes.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des études précédentes ont montré que l’effet de la Queuine synthétique augmentait la survie de neurones dopaminergiques et corticaux dans des modèles in vitro des maladies de Parkinson et d’Alzheimer. Il est nécessaire maintenant de confirmer ces effets sur un modèle in vivo. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de maladies neurodégénératives dont l’origine provient d’une altération du microbiote intestinal, ainsi que d’en étudier les répercussions histologiques et comportementales associées. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes. De plus, le modèle in vivo de rongeur permet de moduler différentes variables impliquées dans l’altération du microbiote intestinal, à savoir le régime ou les compléments alimentaires.
2. Réduction
Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=12) pour le projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8-10) utilisant un protocole d’antibiothérapie similaire au notre à l’exception de la fréquence de gavage qui est plus faible dans ce projet (1 par jour contre 2 par jour) sur demande du sponsor. Or un seul gavage quotidien d’antibiotiques semble diminuer l’efficacité de l’antibiothérapie pour détruire le microbiote ce qui pourrait augmenter l’hétérogénéité du modèle entre les souris. Par ailleurs, le taux de mortalité de ce modèle étant très peu reporté dans la littérature, il est difficile d’estimer réellement la mortalité de ce modèle. Ainsi, le faible recul de ce modèle au sein de l’entreprise nous pousse donc à choisir un N = 12 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux pour les groupes ne subissant pas d’antibiothérapie pourrait être réduit car la variabilité attendue sur les différentes analyses pourrait être plus faible. Ainsi cela représente 12 animaux par groupe expérimental (7 au maximum) avec 2 lots par an sur 5 ans, cela donne un total de 840 animaux au total (12 x 7 x 2 x 5).
3. Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques. Les animaux sont familiarisés avec l’ensemble des outils de mesures ainsi qu’aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Les administrations et prélèvements sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Pour l’administration de l’antibiothérapie : – les administrations se font par gavage pour limiter la déshydration des animaux liée à une aversion pour le goût des antibiotiques. Ce type d’administration permet de limiter la perte de poids. Afin de monitorer la perte de poids des animaux, les souris sont pesées toutes les semaines. Au cours de l’administration, le comportement et la déglutition de la souris sont surveillés avant que celle-ci ne soit remise dans sa cage et à nouveau surveillée. L’amphotéricine B est administrée pour prévenir de l’apparition d’infections opportunistes. Pour les prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire, le site de prélèvement est alterné entre la gauche et droite pour limiter la souffrance et le saignement est estompé par une pression sur la joue avec une compresse pour limite la perte de sang. Les prélèvements sanguins intracardiaques sont effectués sous anesthésie gazeuse et analgésie (30min avant l’acte). Si un des points limites et/ou d’arrêts sont atteints, les animaux sont soumis à une prise en charge adaptée ou mis à mort respectivement. Par ailleurs, trois sortes d’enrichissement seront mises en place dans les cages afin de limiter le mal être de la souris lié à l’isolement. De plus, les souris seront disposées dans des cages transparentes mises côtes à côtes pour qu’elles puissent se sentir et s’observer.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris, et particulièrement la souche C57Bl6, est l’espèce de référence dans l’étude des maladies du microbiote intestinal et permet d’établir de nombreux points de comparaison dans la littérature sur ce sujet. En effet, la souris est un mammifère omnivore possédant de grandes similarités avec l’Homme en termes d’anatomie et de physiologie du système digestif et intestinal. En outre, l’utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la suite du projet pour le sponsor. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes souris adultes (15 semaines) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les pathologies liées à la dysbiose intestinale sont obtenus chez des souris jeunes adultes (>3-6 mois).