Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 18/12/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-639750)
2 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour prélèvement de tissus et de sang, une autre conservée pour l’élevage. Chaque animal subit une biopsie de la queue, un régime destiné à provoquer une stéatose du foie avec inflammation et fibrose, et des prélèvements de sang répétés sous anesthésie. Le porteur indique que le régime peut entraîner une prise de poids et que le tamoxifène administré peut provoquer une perte de poids et des atteintes des testicules chez les mâles. L’étude porte sur le rôle d’un composant de la matrice du foie comme cible thérapeutique et biomarqueur de la maladie du foie gras.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les hépatopathies métaboliques, telles que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et le stade avancé stéatohépatite non alcoolique (NASH), sont en forte progression dans les pays développés et atteignent à ce jour 25% de la population mondiale, devenant la première cause de maladie chronique du foie. La surconsommation d’aliments hautement transformés, pauvres en nutriments et riches en graisses et en sucres contribue largement au développement de la NAFLD/NASH. Les complications liées à la NAFLD/NASH comprennent principalement l’inflammation et la fibrose qui peuvent être suivies par le développement d’une cirrhose et/ou d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables du développement de la NAFLD/NASH et de la progression vers le CHC restent à élucider. À ce jour, il n’existe aucun médicament cliniquement approuvé pour traiter ou limiter la progression de la NAFLD/NASH. Il existe également un besoin non satisfait de développer des tests non invasifs pour le dépistage, le diagnostic, la stadification et le suivi de la réponse thérapeutique à ces maladies. La matrice extracellulaire (MEC) joue un rôle majeur dans la progression de la maladie en étant notamment impliquée dans l’établissement et la chronicité de l’inflammation et la fibrose de divers tissus. Inflammation et fibrose sont deux caractéristiques des hépatopathies métaboliques et sont clairement liées à la progression vers le cancer. Notre laboratoire se focalise principalement sur l’étude d’un des composants spécifiques de la MEC et notre équipe, entre autres, a montré que ce composant favorise l’inflammation et la fibrose dans le cancer et dans d’autres pathologies. Cependant, son rôle dans la progression de la NAFLD/NASH n’est pas encore connu. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de ce composant spécifique de la MEC dans le développement de la NAFLD/NASH, son utilisation en tant que biomarqueur potentiel et d’évaluer l’effet de nouveaux agents ciblant cette nouvelle cible thérapeutique de la MEC en tant que thérapies potentielles de la NAFLD/NASH.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
En élucidant le rôle d’un composant spécifique de la matrice extracellulaire (MEC) dans les hépatopathies métaboliques à l’aide d’animaux transgéniques, nous espérons pouvoir établir le rôle de cette molécule comme biomarqueur de la maladie pour aider au diagnostic et/ou identifier la progression ainsi que pour le pronostic des patients susceptibles de développer des NAFLD/ NASH. Cette étude établira également si ce composant peut être une cible thérapeutique dans la NAFLD/ NASH et l’utilisation potentielle de nouveaux agents inhibiteurs de cette nouvelle cible thérapeutique comme médicaments anti-fibrotiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux subiront une biopsie au niveau de leur queue faite sous anesthésie (durée 5 minutes). Un groupe d’animaux éveillés recevra une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Un second groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 4, 8 ou 12 semaines. Les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 3, 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 4, 8 ou 12 semaines respectivement). Les animaux anesthésiés seront imagés une fois par semaine (3 fois au total). La durée de l’imagerie est d’environ 5 minutes. Un troisième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée de 5 minutes) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés recevront une injection par jour pendant 5 jours consécutifs (30 secondes par injection). Le schéma d’injection de 5 jours sera répété à un intervalle de 4 semaines (3 ou 4 séries d’injections au total). Des échantillons de sang seront prélevés sur des animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). Un cinquième groupe d’animaux, éveillés ou anesthésiés, recevront une injection (30 secondes). Des micro-échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) 7 fois sur une durée totale de 48 heures. Les animaux anesthésiés seront imagés (durée 5 min) 4 fois sur une durée totale de 48 heures. Un sixième groupe d’animaux sera soumis à un régime spécial pendant une durée totale de 8 ou 12 semaines. En outre, les animaux éveillés ou anesthésiés recevront une injection une fois par jour tous les deux jours pendant une durée totale de 4 semaines. Des échantillons de sang seront prélevés sur les animaux anesthésiés (durée 5 min) une fois toutes les 2 semaines (au total 5 ou 7 fois pour les animaux étudiés pendant 8 ou 12 semaines respectivement). L’ensemble de ces animaux sera soumis à un jeûne de 5 heures (une fois).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux recevront un régime spécial (CDAHFD) pour induire le développement d’une stéatose hépatique avec inflammation et fibrose, des pathologies majoritairement silencieuses – sans symptômes – mais qui pourraient entraîner une prise de poids. Il a été indiqué que l’administration de tamoxifène entraînait une perte de poids. Il a également été rapporté que l’administration de tamoxifène provoque certaines altérations cellulaires dans les testicules des souris mâles pouvant conduire à des péronites, oedèmes du testicule ou hernies. Des prises de sang répétées peuvent dans certains cas entraîner des ecchymoses ou des hémorragies. Il existe également un risque inférieur à 5% d’inflammation et d’infection du site de prélèvement sanguin ou d’injection. Un prélèvement unique effectué au niveau de leur queue (biopsie) pourra entraîner une douleur de courte durée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Une partie des animaux sera euthanasiée pour prélèvement de tissus et de sang et une partie sera conservée pour le maintien de l’élevage.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des échantillons cliniques provenant de patients atteints de NAFL/ NASH sont très limités notamment ceux provenant des étapes initiales de ces maladies du foie. De plus, la génération d’organoïdes de foie à partir de biopsies de ces patients est un véritable challenge du fait de la capacité très limitée de réplication des cellules de ces tissus. Contrairement aux cellules cancéreuses, les altérations cellulaires dans les tissus affectés par les NAFLD n’amènent pas de bénéfice de réplication des cellules. Il existe aujourd’hui différents organoïdes hépatiques utilisés en recherche. Des organoïdes issus d’hépatocytes de patients atteints de NASH ont permis d’élucider des éléments clés de la biologie de la maladie. Cependant, aucun organoïde à ce jour ne permet de reproduire la progression totale depuis l’établissement de la stéatose jusqu’aux stades de l’inflammation, de la fibrose et du cancer. Seul l’animal dans sa globalité, avec l’ensemble des systèmes impliqués dans la pathologie (cytokines des tissus adipeux et muscles, hormones, cellules immunitaires, molécules de la matrice extracellulaire etc.) peut être utilisé. Le projet est complété au maximum par des études effectuées en parallèle in vitro sur des cultures cellulaires.
2. Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux dans l’étude, des échantillons de sang répétés mais de faibles volumes, seront prélevés sur le même animal au cours de la procédure. Les procédures comportant plusieurs points dans le temps seront optimisées pour réduire le nombre d’animaux requis. Le nombre minimal d’animaux pour le projet est calculé en fonction des données de la littérature, et tient compte tenu de la variabilité entre les individus, des groupes expérimentaux et de la complexité de la procédure. Le nombre d’animaux (n) a été évalué en utilisant un test de puissance statistique basé sur des études publiées précédemment et portant sur des questions de recherche similaires. Nous avons également tenu compte de la grande variabilité observée entre les souris mâles et femelles dans maladies hépatiques induites par l’alimentation. Les résultats seront analysés par différents tests statistiques appropriés afin de dégager les résultats significativement différents. Les tissus et coupes histologiques seront également partagés entre les collaborateurs du projet pour ne pas reproduire inutilement les procédures sur les animaux entre les laboratoires.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages avec une surface supérieure à la surface règlementaire minimale, avec de l’enrichissement supplémentaire (maisonnette, tunnel, buchette à ronger, frisure de papier, rouleaux de coton) pour promouvoir l’activité et permettre aux animaux de se cacher, réduisant le stress associé aux procédures. Les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé, weekend et jours fériés inclus, et un suivi plus poussé (poids et alimentation) est réalisé minimum 3 fois par semaine pour détecter au plus tôt tout signe de détresse/ souffrance/ douleur. Lorsqu’elle n’interfère pas avec le protocole expérimental, l’anesthésie est systématiquement utilisée pour réduire au maximum le stress/ douleur des animaux. Les animaux seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant les expériences afin de réduire leur stress.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris reste aujourd’hui le seul animal qui combine la possibilité d’étudier des changements histologiques, biochimiques, morphologiques (animaux génétiquement modifiés) avec un modèle reproductible d’hépatopathie métabolique induite (régime CDAHFD) très proche de la maladie humaine (progression NAFL-NASH-fibrose-cancer hépatique). L’utilisation de la souris est donc indispensable pour décrypter les mécanismes mis en jeu dans ces maladies qui sont aujourd’hui et pour les années à venir, un problème majeur de santé publique. Pour mimer la situation chez l’être humain, les animaux seront utilisés au stade « jeune adulte » (i.e., âgés de 8 à 14 semaines) pour permettre leur suivi longitudinal jusqu’à 3 mois de régime.