Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2022-05-13 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-654625)
14 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Le porteur leur électropore des plasmides dans les cellules souches neurales sous anesthésie, les expose à des traitements dans l’eau et en irradie une partie aux rayons X pour provoquer de la mort cellulaire. Tous sont mis à mort pour prélever le télencéphale, le porteur reconnaissant un manque de données sur les analgésiques efficaces chez cette espèce. Il affirme que la culture cellulaire détruit l’organisation de la niche et que les cellules isolées montrent des comportements « aberrants » absents in vivo.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Notre but est de comprendre quels mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlent la perte des cellules souches neurales adultes dans le cerveau des vertébrés.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Dans son ensemble, ce projet permettra de caractériser les deux mécanismes principaux de perte de CSNs dans le cerveau adulte en conditions physiologiques : la division symétrique neurogénique, et la transdifférenciation. Ces mécanismes seront des candidats intéressants de dysfonction en conditions pathologiques de perte de CSNs, comme le vieillissement ou certains troubles du comportement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédures 2, 3, 4, 6 et 9 : les animaux seront soumis, une fois dans leurs vies et sous anesthésie, à une procédure d’electroporation de plasmides dans les cellules souches neurales. Cette manipulation prend environ 1 à 2 min par poisson. Procédures 5 et 7 : les animaux seront donc soumis à un traitement administré dans l’eau de nage. Cette manipulation prend moins d’une minute par lot de poisson car il s’agit ‘juste’ de les transférer d’un bac a un autre (dans lequel a déjà été dilué le traitement). Il y a ensuite la durée du traitement mais sans action car les poissons sont libres de nager dans leurs bacs. Procédure 10 : les animaux seront soumis à une relativement faible irradiation aux rayons X de 80Gy afin d’induire une légère augmentation des évènements de mort cellulaire. Cette manipulation se passe en plusieurs ‘étapes’ : le transfert des poissons dans des bacs isothermes (moins d’une minute pour transférer les poissons dans un aquarium avec 3cm de hauteur) et le traitement dans l’irradiateur des poissons (dans leur aquarium) qui dure un maximum de 57 min pour une dose de 80Gy.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Nous ne prévoyons aucun effet indésirable ou nuisance sur les animaux. Si un effet indésirable inattendu apparait nous arrêtons cette expérience et mettrons a mort les animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux doivent être mis à mort afin de prélever le télencéphale pour l’analyser.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous souhaitons comprendre un aspect fondamental de la biologie des cellules souches neurales (CSNs), à savoir comment ces cellules peuvent être perdues dans le cerveau adulte. Le travail sur CSNs en culture, bien que techniquement possible, a révélé que les CSNs isolées montraient des comportements aberrants jamais observés in vivo, notamment concernant leur mode de division. Ce paramètre impacte de façon directe le maintien ou la déplétion des populations souches. Par ailleurs, à l’heure actuelle, la transdifférenciation, pourtant importante in vivo n’a pas été observée in vitro. Enfin, par imagerie intravitale, il a été démontré que les choix de destins des CSNs sont contrôlés à l’échelle de la population et impliquent une coordination spatio-temporelle entre cellules au sein de leur niche. Toute approche in vitro détruit cette niche et cette organisation spatiale.
2. Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous limiterons précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Concernant les procédures de traçage et d’électroporation, différents articles publiés ces dernières années montrent que le comptage d’environ 150 cellules sur un minimum de 10 animaux est suffisant pour rendre compte des choix effectués, de façon comparable à un comptage de la population globale. Ces valeurs suffisent à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test de Fischer) des choix de destin entre des CSNs contrôles et manipulées. Nous travaillerons donc dans chaque cas avec 10 animaux et uniquement si besoin certaines expériences seront répétées (maximum 3 répétitions). Concernant l’utilisation d’inhibiteur pharmacologique, nous travaillerons avec 10 animaux par condition ce qui suffit à mesurer une différence statistiquement significative du nombre (test de Student) et de la proportion (test exacte de Fisher) de CSNs activées versus non-activées entre des animaux contrôles et des conditions de blocage des voies de signalisation.
3. Raffinement
Les manipulations, invasives ou nécessitant une immobilisation temporaire seront conduites sur animaux anesthésiés. Les inductions (tamoxifène, doxycycline) seront administrées dans l’eau de nage. Les animaux sont toujours maintenus en groupe afin de garantir leurs bien-être. Nous suivrons quotidiennement les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une mise à mort. Chez Danio rerio, il y a un manque d’information sur les effets et la spécificité des produits « classiques » analgésiques. Cependant, une étude récente suggère l’utilisation de lidocaine 2-5 mg/ml dans le bain de réveil. Nous suivrons cette procédure aussi souvent que possible.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi le poisson téléostéen Danio rerio. Le cerveau adulte de Danio rerio, à la différence des modèles « classiques » mammifères, maintient un grand nombre de CSNs. Utiliser cette espèce permet donc d’avoir accès à un beaucoup plus grand nombre de CSN par animal. Ces cellules sont également organisées en une monocouche superficielle au lieu d’être profondes, permettant des approches in toto qui évitent de perdre des cellules comme lorsqu’un organe est analysé sur coupes. Ces deux points répondent au principe de « réduction ». Par ailleurs, les CSNs de Danio rerio sont identiques aux cellules souches des mammifères (cellules gliales, quiescentes, capables d’auto-renouvellement et de multipotence, et dont l’état d’activation est contrôlé par la voie de signalisation Notch). Les résultats obtenus seront donc directement transposables aux mammifères. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune (3 mois post-fécondation [mpf]), car nous travaillons sur la biologie des CSNs adultes. Les premiers signes de ralentissement de l’activité des CSNs sont observés in vivo à environ 5-6 mpf, et il est important également de nous placer avant ce stade.