Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/02/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-666986)
1600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures à la souffrance déclarée modérée pour 500 et sévère pour 1100, les 500 témoins étant proposés à l’adoption et les 1100 exposés tués. Ils sont plongés 96 heures dans des concentrations croissantes d’un produit chimique industriel pour déterminer la dose qui tue la moitié des poissons, sous jeûne pendant toute la durée. Le porteur décrit des pertes d’équilibre, des difficultés respiratoires, des lésions cutanées et des déformations du corps, la gravité des signes pouvant entraîner la mise à mort. Il indique proposer d’abord au client des méthodes de calcul ou l’usage d’œufs mais juge le poisson juvénile « parfois nécessaire », au service de l’étiquetage réglementaire des produits.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’évaluation des composés chimiques sur l’environnement (selon réglementations) nécessite des données de toxicité sur le compartiment aquatique. Pour cela, des essais sont à mener sur les différents niveaux de la chaine alimentaire (des algues aux poissons en passant par les zooplanctons). Ce projet a pour but d’évaluer les effets de produits chimiques en déterminant une concentration induisant 50% de mortalité sur les poissons (Danio rerio).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats obtenus grâce à ces essais permettent d’approfondir la connaissance de la toxicité des produits chimiques. Evaluer ainsi la toxicité de ces produits utilisés industriellement permet d’appréhender leurs potentiels impacts environementaux s’ils sont amenés à se retrouver dans le milieu naturel. Cela permet également d’aider le fabricant à s’orienter vers la fabrication de produits moins nocifs pour l’Homme et l’Environnement, et à reformuler leur produit si nécessaire. Ces données peuvent aussi servir à l’étiquetage des produits et à la détermination des pictogrammes de danger.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les poissons seront pêchés à l’épuisette un à un et transférés immédiatement (durée de transfert d’environ 5 secondes) de l’aquarium aux récipients d’essai au début de l’essai, de l’ancien au nouveau récipient d’essai après 24h, 48h, 72h, et du récipient d’essai à l’aquarium de stabulation ou au bain d’euthanasie à la fin de l’essai après 96h (ou au cours de l’essai si l’individu atteint des points limites). Les poissons seront exposés à différentes concentrations du produit à tester (solubilisé dans l’eau) durant les 96h de l’essai.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
S’agissant d’essais écotoxicologiques sur de nouveaux produits, les effets indésirables sont inconnus. Cependant, un essai peut potentiellement entrainer la manifestation de signes cliniques pouvant modifier l’état de santé des poissons, concernant notamment : – certains signes comportementaux (perte d’équilibre, difficulté respiratoire, attitude inhabituelle, et agressivité) – l’aspect physique (perte de poids, décoloration pigmentaire, déformations du corps et lésions cutanées). L’accumulation et/ou la gravité des effets visibles chez un poisson peut entrainer sa mise à mort. La norme demande une mise à jeun des poissons 24 heures avant l’essai et pendant toute la durée de l’essai (96h), entrainant une sensation de faim chez le poisson.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les poissons ayant servis en tant que témoins négatifs sont récupérés et donnés à l’adoption. Les poissons ayant été exposés à des concentrations en produit chimique sont mis à mort à la fin de la procédure. Leur réutilisation engendrerait un potentiel biais dans les futures analyses étant donné qu’ils ont déjà été exposés à des substances chimiques leur ayant laissé de potentielles séquelles au niveau physiologique et cellulaire.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Préalablement à la mise en place de ce projet, il est systématiquement proposé au client des méthodes alternatives : – une alternative basée sur une approche mathématique – une alternative basée sur le regroupement de substances et références croisées – une alternative basée sur l’utilisation des oeufs de poissons. Cette dernière implique l’utilisation des poissons au stade embryonnaire et non juvénile/adulte, mais il est précisé que cela ne permet pas de mettre en évidence les déchets pouvant être plus toxiques que le composé initial, ou encore que les molécules de certains produits ne peuvent pas atteindre l’embryon à cause de la paroi de l’oeuf qui forme une barrière. L’utilisation du modèle Danio rerio est donc parfois nécessaire pour déterminer l’effet de la métabolisation des produits.
2. Réduction
En amont du projet, une bibliographie sur le produit chimique est effectuée afin de vérifier l’absence de données correspondant au projet et donc d’éviter un essai non indispensable. S’il s’agit d’un produit appartenant à la même famille d’un autre produit précédemment testé, il peut être judiceux de s’affranchir d’un essai préliminaire pour réduire le nombre de poissons utilisés. La ligne directrice préconise : « Un minimum de sept poissons doit être utilisé à chaque concentration expérimentale et dans le(s) témoin(s). Les poissons doivent être répartis au hasard dans les différents groupes de traitement. Aucune répétition inutile des cuves expérimentales n’est requise. » Notre projet privilégie un mode opératoire séquentiel : une série de concentrations du produit doit être testé, mais seules les concentrations les plus faibles sont testées dans un premier temps. Si aucun effet n’est observé, alors les concentrations plus élevées sont testées. Cela permet d’éviter d’exposer inutilement des poissons à des concentrations trop élevées. Selon la toxicité des produits testés, différents scénarii d’analyses sont possibles. Dans le cas où 50% des produits testés ne présentent pas de toxicité, alors, sur l’ensemble des essais réalisés, nous observerons une réduction d’effectif de 27%. Les résultats sont ensuite analysés statistiquement grâce à des modèles permettant l’obtention d’une valeur indiquant la concentration en produit qui engendre la mort de 50% des poissons. Il se peut que les produits à tester ne soient pas solubles, or, la tendance actuelle lors de la réalisation des essais d’écotoxicologie est de s’affranchir de l’utilisation de solvant en optimisant les méthodologies de mise en solution d’un composé peu soluble . Par conséquent, le nombre de poissons utilisés lors d’un projet sera réduit.
3. Raffinement
Les béchers accueillant les poissons lors de la procédure sont entourés d’un poster reproduisant le milieu naturel des poissons. Le milieu dans lequel se trouvent les poissons est renouvellé tous les jours. La température, l’oxygène dissous et le pH sont contrôlés quotidiennement. Tout au long d’un essai, l’apparition de points limites précoces est surveillée. L’observation et l’enregistrement de ces signes doit se faire au minimum deux fois dans les premières 24 heures avec au moins 3 heures d’intervalle entre deux observations (exemple : 2h, 5h, et 24h après le début de l’exposition). Cette observation doit ensuite se faire deux fois par jour (matin et soir de préférence) et les points limites sont évalués dans la grille de score. Les poissons atteignant un score témoignant d’une douleur, d’une souffrance ou d’une angoisse intense sont retirés de l’essai et mis à mort . Les poissons non exposés (témoins) sont récupérés et placés dans un aquarium de stabulation afin d’être conservés jusqu’à leur adoption.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les poissons sont des organismes qui intègrent les données de l’environnement dans lequel ils évoluent car ils se situent en haut de la chaine trophique et représentent un bon indicateur de leur environnement. L’utilisation des poissons permet de mettre en évidence la potentielle toxicité des déchets qu’ils rejettent après avoir dégradé le produit initalement présent dans le milieu. Cet impact ne peut pas être mis en évidence par les oeufs ou les larves de poissons qui ne dégradent pas ou moins les produits. Les poissons utilisés sont de l’espèce Danio rerio comme préconisé par la ligne directrice suivie lors de cette procédure. Leur taille varie entre 1 et 2 cm de longueur (juvéniles) pour respecter les critères de taille indiqués. Le Danio rerio est un modèle scientifique très étudié et utilisé, de part sa facilité d’élevage, d’entretien, et de reproduction, avec des conditions environnemenales de bien-être peu exigeantes et facile à mettre en place. Selon la norme OCDE les poissons utilisés seront des juvéniles de 1 à 2 cm (poissons n’ayant pas atteint la maturité sexuelle).