Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-712173)
108 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique, puis plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie jusqu’à un prélèvement terminal à huit semaines, pour comparer quinze constructions et sélectionner les plus efficaces. Le porteur affirme que l’injection de ces vecteurs est bien tolérée chez le rongeur et ne provoque aucun effet indésirable. Il présente cette étude pilote comme un moyen de réduire le nombre d’animaux d’une seconde étude à venir, affirme qu’aucune méthode ne remplace l’essai in vivo, et euthanasie toutes les souris pour prélever leurs tissus.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l’ensemble des muscles de l’organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possible d’utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV). Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes, notamment le muscle et le cœur. Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine ont été générés. Ils permettent une récupération partielle de la fonction musculaire dans les modèles animaux de la DMD. Cependant, un rejet immunitaire contre ces produits thérapeutiques est parfois observé, avec une perte de l’effet thérapeutique. L’objectif du présent projet est d’évaluer de nouveaux produits de thérapie génique, qui pourraient permettre de combler le déficit en Dystrophine, tout en évitant ce rejet immunitaire. Ces nouveaux produits pouvant être plus ou moins stables ou plus ou moins fonctionnels dans les cellules musculaires, nous en testerons plusieurs, afin d’évaluer leur efficacité après injection intraveineuse chez la souris mdx, modèle murin de la DMD.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de sélectionner les nouveaux produits de thérapie génique les plus efficaces (en termes d’efficacité du transfert de gène dans différents muscles, de niveau d’expression du produit thérapeutique, et de l’efficacité à corriger la pathologie musculaire des souris mdx au niveau histologique), afin d’ensuite évaluer la ou les meilleures (entre 1 et 3 maximum) pour leur efficacité thérapeutique et leur immunogénicité dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype DMD marqué, et cela avec un nombre d’animaux plus important par groupe expérimental afin d’assurer la robustesse de ces évaluations phénotypiques. Cette seconde étude fera l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentant un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la DMD par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire, afin de pouvoir ensuite prétendre à réaliser un essai clinique chez des patients DMD.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l’animal. Durée de l’intervention: maximum 5 min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d’une veine mandibulaire le jour de l’injection, puis à 2 semaines et 4 semaines post-injection (3 prélèvements par animal). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 10% maximum du volume sanguin circulant de l’animal. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave, à 8 semaines post-injection. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
(i) Injection intraveineuse: l’injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l’injection (maximum 5 min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d’un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d’une veine mandibulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront donc espacées d’au moins 2 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l’animal.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs) et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité (différents types de lésions). Ce projet, qui vise à évaluer le niveau d’expression et l’efficacité de nouveaux produits thérapeutiques pour notamment réduire les lésions musculaires liées à la pathologie DMD, ne peut donc être réalisé in vitro.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses de tolérabilité et d’expression qui seront réalisées ici. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D’autre part, par l’identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettra de réduire le nombre total d’animaux qui seront à inclure dans l’étude qui suivra et qui visera à évaluer l’efficacité thérapeutique des meilleurs de ces nouveaux produits de thérapie génique dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype plus marqué. En effet, tester d’emblée l’efficacité thérapeutique de l’ensemble des 15 constructions différentes dans cet autre modèle animal aurait demandé l’inclusion d’un nombre très important d’animaux, supérieur au nombre qui sera inclus au total via ces 2 études.
3. Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d’hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d’enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l’instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d’autre alternative). 4) Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s’avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’objectif de cette étude requiert l’utilisation d’un modèle animal de la DMD, dans lequel l’expression de Dystrophine est absente, et cela afin de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux produits de thérapie génique. Il existe 3 modèles animaux majeurs de la DMD: la souris mdx, le rat DMD et le chien GRMD. La souris mdx présente des lésions musculaires typiques de la DMD, mais assez peu de symptômes de la maladie. Cette dernière limitation n’aura pas d’impact sur les objectifs de cette étude, puisqu’aucune évaluation phénotypique ne sera réalisée dans cette étude pilote. L’intérêt du modèle de la souris mdx pour cette étude repose par contre sur la facile disponibilité des animaux, ainsi que sur leur petite taille, réduisant les quantités de vecteurs nécessaires pour les injections (les vecteurs étant injectés en dose/kg d’animal). Les animaux seront injectés à l’âge adulte, entre 10 et 12 semaines d’âge. Avant l’âge de 8 à 10 semaines, la souris mdx présente des phénomènes de régénération musculaire qui peuvent avoir un impact négatif sur l’efficacité du transfert de gène à l’aide vecteurs viraux AAV. Les souris devront donc être âgées à minimum de cet âge. L’évolution de la pathologie chez les souris mdx étant ensuite lente, nous nous donnons une fourchette de 3 semaines d’âge de différence pour les animaux à inclure (mini 10 semaines, maxi 12 semaines), afin de simplifier la gestion de l’inclusion des animaux dans l’étude, qui sera adaptée selon la disponibilité des animaux chez l’éleveur, sans que cela n’ait d’impact sur les résultats de l’étude.