Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-03-29 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-719895)
Quatre à sept injections intradermiques avec un adjuvant qui provoque une forte inflammation aux points de piqûre et des douleurs articulaires, quatre à six prélèvements sanguins sur animal vigile, puis une anesthésie générale de quinze minutes suivie d’une exsanguination de deux minutes: 2 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur sang fournira des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine bactérienne, destinés à servir d’outil de laboratoire pour étudier la virulence de staphylocoques de la peau. La seconde lapine est immunisée quinze jours après la première, ce décalage permettant selon le porteur de renoncer à l’immuniser si la protéine était mal supportée. Le même document décrit deux plateformes, des blocs de luzerne, des friandises aromatisées deux fois par semaine et une heure quotidienne dans un parc intérieur.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Une neurohormone humaine sécrétée par les terminaisons nerveuses dans les parties superficielles de la peau, le CGRP (Calcitonin Gene Related Peptide), a été identifiée par le laboratoire comme facteur induisant une augmentation de la virulence de staphylocoques du microbiote cutané. Nous avons ainsi montré que le CGRP provoque une augmentation de la virulence de Staphylococcus epidermidis, par un mécanisme faisant intervenir la protéine chaperonne DnaK, alors retrouvée au niveau du sécrétome de la bactérie. Le gène dnaK de Staphylococcus epidermidis a été cloné et la protéine recombinante DnaK produite et purifiée à partir d’E. coli. Le projet vise à élucider ce nouveau mécanisme d’activation de la virulence par le CGRP. Pour ce faire, i) nous caractériserons l’interaction entre le CGRP et la protéine DnaK ; ii) nous étudierons le rôle de DnaK dans l’activation de la virulence, c’est-à-dire en tant que protéine effectrice et/ou en tant que protéine activatrice d’un messager secondaire : iii) DnaK étant capable de se lier à une multitude de ligands, en plus du CGRP, d’autres neurohormones de la peau seront testées pour leur capacité à activer la virulence en interagissant avec la protéine DnaK ; iv) enfin, la protéine DnaK étant l’une des protéines les plus conservées chez les procaryotes, nous testerons ce système de communication sur d’autres bactéries du microbiote cutané. L’intervention d’une protéine chaperonne procaryote dans la détection d’un signal eucaryote n’ayant jusqu’à présent jamais été mise en évidence, les résultats de ce projet pourraient ainsi mener à la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries. A long terme, la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP permettra par la suite de proposer de nouvelles molécules à visée thérapeutique pour le traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que le psoriasis.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les anticorps polyclonaux anti Dnak seront d’abord des outils de lignage et de diagnostic. Ils nous permettront d’étudier le rôle de DnaK dans l’augmentation de la virulence chez les procaryotes, la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries et la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Prélèvement sur animaux vigiles et injection transdermiques. Prélévement vigile maximum 6 minimum 4. Injections intradermiques maximum 7 minimum 4. Les temps de prélèvement et d’injection seront de 1 à 2 minutes chacun. En fin de procédure une anesthésie générale de 15 minutes suivie d’une exsanguination de 2 minutes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront mis à mort après l’immunisation afin de recueillir le maximum de sang et donc d’anticorps polyclonaux.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des méthodes de production d’anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d’obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l’animal. De plus la qualité des banques de phages est très variable et donc les résultats très aléatoires. La diversité des clones obtenus par sélection sur phage display est extrêmement faible et l’affinité des anticorps obtenus médiocre. Le lapin permet d’obtenir des anticorps de fortes affinités grâce à la longueur de leur partie variable. La finalité de notre projet est d’étudier les produits de dégradation de la protéine Dnak il est donc important de posséder des anticorps qui ciblent l’intégralité des épitopes immunodominants.
2. Réduction
Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d’anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins seraient nécessaires pour obtenir la quantité d’anticorps indispensable à nos études. Les deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine Dnak recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.
3. Raffinement
Les injections intra-dermiques comme les ponctions sanguines seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les règles d’asepsies seront respectées afin d’éviter tout risque d’infection aux sites d’injection et de ponction. Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané d’antalgique morphinique adapté à leur poids. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure par la mise a mort. Les deux lapines seront hébergées ensemble dans des gages aux normes européennes elles disposeront de nourriture et d’eau ad libitum. Leur cage est équipée de deux plateformes et deux abris fixes. Le milieu est enrichi de briquettes de bois et de bloc de luzerne. 2 fois par semaine elles reçoivent des friandises sous forme de bonbons aromatisés spécialement développé pour les lapins. Elles seront sortie 1h par jour dans un « parc » intérieur agrémenté de jouets.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des parties variables des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.