Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-755943)
268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un analogue de la vitamine D est appliqué sur leurs oreilles pour déclencher un eczéma avec rougeurs et croûtes, et certaines lignées reçoivent des injections répétées pour dépléter des cellules immunitaires. Elles sont mises à mort pour analyser la réponse immunitaire de la peau et des ganglions. Le porteur affirme que la complexité de la réaction immunitaire rend nécessaire le recours à l’expérimentation in vivo pour confirmer des résultats déjà obtenus in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La dermatite atopique est une maladie de la peau pouvant être associée à d’autres affections telles que l’asthme ou la rhinite allergique. La dermatite atopique, caractérisée par du prurit et de l’eczéma, affecte 10% à 20% des enfants et 1% à 3% des adultes. Les patients présentent une inflammation de la peau avec notamment une infiltration de cellules immunitaires. Nous utilisons un modèle murin de dermatite atopique, générée par l’application d’un analogue à la vitamine D, le calcipotriol (MC903), directement sur la peau. La dermatite atopique générée dans ce modèle est due à l’induction de la cytokine TSLP au niveau des kératinocytes de l’épiderme. Nous avons démontré que les cellules dendritiques activées par TSLP expriment OX40L et que cette molécule est impliqué dans l’induction de lymphocyte T régulateur (Treg) capable de limiter réponse inflammatoire causant l’eczéma (non publié). Dans ce projet, nous souhaitons poursuivre l’utilisation de ce modèle murin de dermatite atopique afin d’étudier plus particulièrement le rôle des cellules dendritiques exprimant OX40L induisant les Treg.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’identification et la caractérisation d’une population de cellule dendritique capable d’induire des lymphocytes T régulateurs anti-inflammatoire permettant de limiter la réponse immunitaire de la peau permettrais de définir une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de la dermatitie atopique, et aussi dans d’autres pathologies impliquant le systéme immunitaire (maladies autoimmunes, cancer). En effet, cibler ces cellules pourrait permettre de moduler la réponse immunitaire à notre convenance, à savoir de la limiter dans le cas des maladies allergiques ou autoimmunes, ou à l’inverse, de la favoriser dans le cas du cancer.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Une application d’un analogue de la vitamine D sera réalisé sous anesthésie légére au niveau des oreilles. Les souris seront traitées tous les deux jours pour un maximun de 6 traitements de 1 minute chacun (6 x 1 min = 6 min). Lors des traitements 5 et 6, les animaux développeront un eczéma localisé au niveau des oreilles, ce qui entrainera l’apparition de rougeur et d’éventuelles petites croutes. Afin de dépléter une population de cellule immunitaire, une lignée de souris sera soumise à deux injections une semaine avant de débuter la procédure d’application de l’analogue de la vitamine D. La déplétion sera ensuite maintenu lors du traitement avec l’analogue de la vitamine D via une injection au jour 0 puis au jour 5 du traitement avec l’analogue de la vitamine D. (4 injections au total d’une durée de 2 secondes chacune). Pour induire la délétion de notre gène d’intérêt, les animaux de la lignée concernée recevront une injection par jour pendant 5 jours. Des injections permettant de maintenir la délétion du gène d’intérêt seront ensuite effectuées tout les 3 jours pendant la procédure d’application de l’analogue de la vitamine D (9 injections d’une durée de 2 secondes chacune). Les sites d’injection seront alternés entre les différentes injections. Aucun prélévement sur animal vigile et aucune procédure chirurgicale ne sont prévues.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux developperont un eczèma au niveau du site d’application de l’analogue de la vitamine D, à savoir les oreilles, qui pourront engendrer de légéres démangeaisons, rougeurs et formation de croute. Aucun effet secondaire notable n’est attendu suite aux injections.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de chaque procédure tous les animaux traités seront mis à mort à la fin du traitement pour analyser la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la peau.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe ou par d’autres laboratoires. Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et des réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et confirmer les résultats obtenus précédemment.
2. Réduction
Ce protocole sera appliqué à un total de 8 lignées de souris génétiquement modifiées et 2 lignées de souris sauvages afin d’identifier les rôles de différentes molécules et cellules de la réponse immunitaire. Chaque lignée sera constituée de quatre groupes de 6 animaux, pour un total de 24 animaux au maximum. Deux groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) serviront à l’analyse de l’expression des gènes dans les ganglions lymphatiques et au niveau des oreilles des animaux. Ces animaux permettront également d’effectuer une analyse histologique de la peau. Les deux autres groupes (1 groupe mutant comparé à 1 groupe contôle) seront utilisés pour caractériser les populations de cellules présentes dans ces organes. L’effectif de 24 animaux par lignée est l’effectif minimal qui nous permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres mesurés. De plus le traitement au niveau de l’oreille droite des souris nous permettra d’utiliser l’oreille gauche en tant que contrôle non traité. (Suite à un test statistique de normalité, nous effectuerons des test ANOVA à 2 voies afin de comparer deux génotypes (contrôle et mutant) traités ou non avec l’analogue de la vitamine D.)
3. Raffinement
L’application de l’analogue à la vitamine D sur les oreilles ne nécessite qu’une anesthésie légère. A partir du jour 9 jusqu’au jour 11 on observe un épaississement et une rougeur des oreilles. Cela peut être accompagné de légères démangeaisons, mais qui ne modifient pas le comportement des souris (toilettage, posture et activités normales). Néanmoins, si une souris présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactive après stimulation, ou si des lésions au niveau des sites de traitement apparaissent, elle sera retirée de l’étude et pourra bénéficier de soins après l’avis du vétérinaire. Certaines lignées nécessiteront l’emploi d’injections. Les sites d’injections seront alternés et attentivement surveillés. En cas d’inflammation au niveau d’un site d’injection, l’animal sera retiré de l’étude et bénéficiera de soins après l’avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l’animal sera euthanasié immédiatement.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Les phénomènes mis en oeuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu différents organes et réseaux cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d’éventuelles cibles thérapeutiques. Le fonctionnement du systéme immunitaire de la souris est très proche de celui de l’Homme, de plus la peau des souris au niveau des oreilles est très similaire à la peau humaine. Ce modèle est donc pertient pour étudier des pathologies inflammatoires de la peau, dans le cas présent la dermatite atopique, qui touche 20% des enfants et 3% des adultes. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d’étudier le système immunitaire mature à l’âge adulte.