Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2023-06-26 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-778705)
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Porteuses d’un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles développent une paralysie progressive et reçoivent des injections d’agents de contraste et d’un agent inflammatoire sous anesthésie, avec des tests moteurs et de l’imagerie, pour étudier la barrière protégeant le cerveau. Le porteur indique que la maladie provoque des troubles de la marche, une atrophie musculaire et un décès prématuré, et que l’agent inflammatoire comporte un risque de choc septique. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires de cette barrière ne sont pas assez développés pour une pathologie comme la SLA.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le principal objectif de ce projet est de caractériser l’intégrité de la barrière entre le sang et le tissu nerveux (Barrière Hémato-Encéphalique (BHE)) au cours de l’évolution de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) chez un modèle murin transgénique de cette maladie portant une mutation dans un gène impliqué dans la maladie. Le second objectif est d’identifier des marqueurs circulants dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de l’intégrité de la BHE chez la souris. Les autres objectifs sont de valider de nouvelles techniques non-invasive d’exploration de l’intégrité de la BHE chez l’animal vivant, réduisant ainsi la nécessité de mettre à mort les animaux et permettant de compléter la caractérisation de ce modèle murin de SLA.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Nous souhaitons mettre en lumière l’implication de l’altération de la BHE dans la SLA. Les explorations innovantes prévues dans ce projet (principalement celles in vivo) n’ont jamais été réalisées dans la SLA, et particulièrement chez ce modèle murin, qui est peu décrit dans la littérature. Nous sommes convaincus que le ciblage de la protéine codée par le gène muté et l’amélioration des modes d’administration de médicaments sont tous deux cruciaux pour l’avancement des thérapies dans la SLA. La validation d’une technique d’évaluation de l’intégrité de la BHE par une méthode d’imagerie in vivo représenterait un réel progrès technologique pour nos projets futurs. Nous pourrons ainsi satisfaire à la régle des 3R avec une réduction du nombre d’animaux utilisés. Démontrer l’altération de la BHE comme mécanisme pathologique de la SLA pourrait inciter au développement de nouvelles molécules thérapeutiques visant à restaurer son intégrité. Les marqueurs circulants d’intégrité de la BHE identifiés chez la souris SLA seront évalués dans une cohorte humaine. Cette étude permettrait d’améliorer notre compréhension de la pathogénèse et du pronostic de la maladie. La recherche de ces marqueurs pourrait également aider à identifier des sous-groupes de patients chez qui les mécanismes de disruption de la BHE seraient différents, menant à une médecine personnalisée des patients avec l’adaptation des protocoles d’administration des médicaments. Il est également envisagé de poursuivre ces explorations chez l’homme à partir d’une autre collection d’échantillons biologiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
– Pesée lors de chaque manipulation (duree :
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les souris transgéniques SLA développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : – Puçage : • Direct: douleur associée à l’injection de la puce par un trocart, prévenue par anesthésie • Indirect: possibilité d’inconfort les premiers jours post-injection. – Injection d’un agent permettant d’induire un syndrome inflammatoire : • Direct : douleur associée à une injection • Indirect (effets de l’agent) : risque de choc septique avec défaillance d’organes à haute concentrations. Il a été choisi une concentration inférieure à celle pouvant induire une mortalité. Une surveillance rapprochée (toutes les 2h pendant 8 h) sera réalisée après l’injection. Durée : < 24 h - Injection d’un agent de contraste photoacoustique: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection des microbulles servant d’agent de contraste ultrasonore: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection d’un cocktail de molécules fluorescentes: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : aucun, euthanasie après injection - Anesthésie : • Direct : stress lié à la manipulation • Indirect : risque lié à l’agent : baisse de la température corporelle. Durée < 1 h - Test comportementaux, pesée : stress lié à la manipulation : sortie de la cage, marche forcée sur un cylindre, contrainte à tenir une grille puis à la lâcher pour le test d’agrippement.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Euthanasie de tous les animaux car nécessité de prélever les organes afin d’observer la perméabilité au dextrans fluorescent et pour réaliser des analyses histologiques visant à caractériser la BHE.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE cellulaires ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA.
2. Réduction
Des analyses de faisabilité et de mises au point seront réalisées sur un faible nombre d’animaux (24 souris) afin d’éviter une utilisation excessive d’animaux liée à une non-maitrise de ces outils d’exploration in vivo de la BHE. Si les résultats de cette procédure sont satisfaisants, nous poursuivrons l’étude en comparant les souris mimant la SLA aux souris contrôles. Le nombre de 12 souris par groupe de souris SLA a été choisi : sur la base d’une analyse de la bibliographie portant sur un sujet similaire et utilisant un autre modèle de souris transgéniques que celui de ce projet et sur la prise en compte de la fragilité de cette souche de souris et de la variabilité du phénotype des souris transgéniques (début de symptômes, etc) et des tests comportementaux utilisés. Les souris contrôles présentant moins de variabilité phénotypique, un nombre de 6 souris par groupe a été retenu.
3. Raffinement
L’enrichissement dans les cages d’hébergement sera systématique : matériel de nidifications, objets de mastication, boite à œuf et/ou « igloo » en plastique ou autres objets conçus par le personnel de l’animalerie. Les souris transgénique SLA développant des troubles de la motilité intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Du fait des problèmes locomoteurs attendus chez ces animaux, un accès à l’eau et à la nourriture sera disponible à hauteur du sol pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés en groupe jusqu’à 5 animaux par cage. Hors expérimentation, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalier et les responsables du projet pendant l’intégralité de l’étude, voir plus régulièrement en cas de début de réactions négatives. Les souris seront sous anesthésie gazeuse lors de chaque expérimentation non comportementale afin de limiter le stress et la douleur. Les souris seront placées sur tapis chauffant (prévention de la baisse de température corporelle) et surveillées constamment durant les périodes d’anesthésie, y compris lors de la phase de réveil faite dans la cage d’hébergement pour limiter le stress. Nous mettrons une feuille d’essuie-tout dans la cage sur la litière pour poser les animaux après l’imagerie pour éviter que la litière colle sur la peau des animaux au niveau du site d’application du gel échographique (une légère couche résiduelle de gel peut être présente même après nettoyage de la peau). Une surveillance accrue (toutes les 2 heures pendant 8 heures) sera également réalisée après administration d’un agent provoquant une réaction inflammatoire aux 12 souris de la procédure de mise au point. La douleur des animaux sera évaluée et les points limites seront déterminés selon une grille de cotation, arbre décisionnel et critères d’arrêt de souffrance pour les souris contrôle, avec une deuxième grille adaptée aux souris SLA.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modèle de souris transgénique utilisé ici possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. C’est par ailleurs ce modèle qui est utilisé au cours de l’étude globale ayant fait l’objet du financement régional. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE in vitro ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA. Les souris seront reçues à leur 5ème semaine de vie. Ceci permettra d’effectuer les 1ères manipulations avant le début d’apparition des symptômes de la SLA. Ce stade de développement des animaux permettra d’intégrer des animaux dans nos groupes où la maladie est en phase pré-symptômatique.