Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-796623)
315 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne de trois à quatre heures pour implanter des électrodes, puis des tests de navigation vers une récompense pendant quinze jours, avant une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. La récompense passe par une stimulation électrique du cerveau ou, à défaut, par une restriction alimentaire limitant la perte de poids à 15 %. Le porteur affirme que la modélisation informatique et les invertébrés ne permettent pas d’étudier ce comportement complexe, la souris étant l’espèce la plus appropriée.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Comprendre les mécanismes neuronaux qui sous-tendent des fonctions cognitives complexes telles que la navigation est un des enjeux majeurs de la recherche en neuroscience. L’objectif du projet est de comprendre comment les interneurones de la couche moléculaire (MLI) du cervelet postérieur (Crus I et/ou Lobule VI) contribuent à l’apprentissage de la navigation orienté vers la récompense. Des études réalisées à la fois chez l’Homme et chez la souris ont révélé une activité des lobules Crus I et VI lors de la réalisation d’une séquence de navigation orientée vers un but. Le système inhibiteur constitué par les MLI contrôle les cellules de Purkinje qui sont à l’origine des signaux de sortie du cervelet vers le reste du cerveau. Ces interneurones jouent donc un rôle clé dans le traitement cérébelleux mais à ce jour leur rôle dans l’apprentissage de la navigation spatiale n’est pas connu.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet vise à comprendre le rôle des interneurones dans le traitement cérébelleux lors d’une tâche de navigation spatiale. Il contribuera ainsi à appréhender le fonctionnement du cerveau en conditions normales et par conséquent aidera à mieux cibler les altérations qui se présentent en conditions pathologiques (Maladie d’Alzheimer, Dyspraxie, Désorientation topographique…).
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un groupe de 15 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d’electrodes sous anesthesie/analgésie (3h) -Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) – Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 150 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d’electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) – Injection de l’agent l’inhibiteur via microcanule à l’état vigile (5min) – Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) – Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 75 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) – Chirurgie stéréotaxique implantation d’electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) – Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) – Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 75 animaux suivront les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) – Chirurgie stéréotaxique implantation d’electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) – Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 15j) – Perfusion intracardiaque sous anesthesie/analgésie (30min)
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20% de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h qui sera pallié par les analgésiques. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seule une chirurgie stéréotaxique permet de cibler spécifiquement des sous régions cérébrales (placement d’électrodes, injection virus, injection d’inhibiteurs). En post-chirurgie les animaux seront isolés pour éviter la dégradation des implants entre congénres mais un jouet d’exploration sera ajouté dans la cage pour améliorer l’enrichissement. L’injection de muscimol via la micro canule n’est pas douloureuse en soi mais elle nécessite l’immobilisation de l’animal pendant environ 1 min. Les souris sont habituées progressivement à cette contention dans un linge avant le début de la procédure et ne présentent donc aucun signe d’inconfort lors de cette manipulation. De par sa nature, notre projet nécessite de réaliser des tests de comportement, néanmoins au cours des tests les animaux sont libres de leurs mouvements pour explorer l’environnement et trouver la récompense. Les tests de comportements pour être reproductibles nécessitent un environnement calme et des souris non stressées. Les expérimentateurs portent une attention particulière à habituer progressivement les animaux à la manipulation ainsi qu’aux différents environnements dans lesquels seront réalisés les tests. La fixation du câble sur l’implant crânien est conçue pour ne pas perturber l’animal dans ses mouvements, lui permettant ainsi d’explorer librement l’environnement à la recherche de la récompense. L’animal sera récompensé préférentiellement par stimulation intracrânienne du circuit de la récompense (MFB) dans le cas où cela ne serait pas possible il sera récompensé par de la nourriture. Cette deuxième option nécessitera la mise en place d’une restriction alimentaire indispensable pour motiver les souris à chercher la récompense (croquette) et ainsi à apprendre la tâche. Néanmoins cette restriction ne dure que quelques jours et la perte de poids est limitée à 15% du poids initial. Pendant le weekend end, les souris ont de la nourriture ad libitum leur permettant de retrouver leur poids initial.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Le prélèvement et l’analyse des cerveaux post-mortem sont indispensables à la validation des procédures. Cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par perfusion intracardiaque.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La modélisation permet d’apporter des informations sur le fonctionnement et les opérations faites par le cerveau mais nécessite des données cellulaires et comportementales. La modélisation ne nous permet pas d’étudier le rôle des interneurones du cervelet dans l’apprentissage d’une tâche de navigation orientée vers une récompense. Les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des comportements complexes ; la souris est donc l’espèce la plus appropriée pour ce type d’études.
2. Réduction
En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux et des analyses statistiques similaires à celles que nous utiliserons, nous estimons le nombre de souris par groupe à 20 souris. La taille des effectifs nécessaires par groupe a également été confirmée par un calcul de puissance (puissance = 80-90%, niveau de signification (alpha)= 0.05, taille de l’effet = moyen à fort)). Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble des 4 procédures, 315 souris seront nécessaires. Néanmoins la procédure 4 étant une alternative à la procédure 3, le nombre maximum de souris ne devrait donc pas excéder 240 animaux.
3. Raffinement
Les souris provenant d’un fournisseur extérieur ont un temps d’adaptation à la pièce d’hébergement de 5-7 jours. Afin de réduire au maximum le stress, les animaux sont habitués à être manipulés 5min par jour par l’expérimentateur avant le début du protocole expérimental. Pendant et après la chirurgie, les animaux recevront des analgésiques pour diminuer la douleur. Les animaux sont placés dans des cages en communauté de 2 à 5. Les cages contiennent de la sciure, ainsi que du matériel pour la construction du nid (nid végétal) et des croquettes de nourriture à ronger. Lorsque la procédure nécessite l’isolement des animaux, un jouet d’exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ces cages sont fermées par une grille et ne sont donc pas hermétiques. Ainsi les informations visuelles, auditives et olfactives peuvent circuler entre les souris. Des points limites sont mis en place afin de réduire, supprimer ou soulager l’inconfort, la douleur ou l’angoisse subis par les animaux. Ils seront suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (grille de scoring). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie gazeuse couplée à des analgésiques. Avant les perfusions intracardiaques, les animaux reçoivent une injection intra-péritonéale d’analgésiques et une surdose d’anesthésique.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le modèle murin est idéal pour répondre à notre question scientifique. En effet, il existe un grand nombre de lignées de souris transgéniques que nous pourrions utiliser dans le cadre de notre projet d’étude du rôle des interneurones dans la navigation spatiale. Dans ce projet nous utiliserons une lignée transgénique qui exprime l’enzyme Cre-recombinase spécifiquement dans les cellules qui expriment la Parvalbumine. L’utilisation de cette lignée permet d’inhiber spécifiquement les interneurones du cervelet. De plus, la souris est un animal explorateur pour lequel de très nombreux tests de comportement ont été développés ainsi tous les travaux antérieurs de l’équipe ont été réalisés chez la souris, notamment les travaux sur lesquels se basent nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l’étude des réseaux neuronaux à l’âge adulte. Les tests comportementaux des différentes procédures devront donc être réalisés sur un cerveau stable d’un point de vue développemental (2 mois). Nous commencerons donc les procédures 1 et 4 sur des souris âgées de 4 à 5 semaines. Au maximum les souris seront âgées de 5 mois à la fin de la procédure dans laquelle ils sont inclus.