Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-856234)
360 animaux non-humains, cobayes, hamsters dorés et gerbilles de Mongolie, vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par injection de leptospires pour tester la virulence de souches bactériennes, l’infection provoquant prostration, poils hérissés et perte de poids, les individus moribonds étant mis à mort. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort par CO2. Le porteur affirme que seuls ces animaux développent des signes proches de la maladie humaine et qu’aucun autre modèle n’existe pour étudier la virulence.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les mécanismes de virulence des leptospires pathogènes restent largement méconnus. Depuis quelques années, le laboratoire a développé des outils génétiques pour l’inactivation de gènes potentiellement impliqués dans la virulence de ces bactéries. Le seul moyen de tester pour la virulence de ces mutants est l’utilisation d’animaux : si un gène code pour un facteur de virulence, l’inactivation de ce gène par l’utilisation d’outils génétiques doit rendre ce mutant non virulent (les animaux survivent à l’infection). Le laboratoire a ainsi publié de nombreux articles sur la caractérisation de mutants non virulents et démontré le rôle de certains mécanismes comme la mobilité et la résistance aux stress, dans la virulence de ces bactéries. Nous envisageons aussi de déterminer les gènes dérégulés lors d’une infection chez la bactérie et l’hôte par des approches de transcriptomique. Le laboratoire peut aussi être amené à tester le caractère virulent de certaines souches cliniques isolées chez des patients présentant des formes plus ou moins graves de leptospirose. Ce projet a donc pour but de tester la virulence de souches de leptospires (mutants obtenus par manipulation génétique ou souches cliniques) et d’identifier les gènes ou voies induites lors d’une infection dans les modèles animaux sensibles (cobayes, hamsters ou gerbilles).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les travaux menés jusqu’à maintenant à l’aide de mutants dans les modèles sensibles à la leptospirose ont permis d’identifier de nombreux facteurs de virulence, ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes de la pathogénèse de la leptospirose. L’analyse transcriptomique de la bactérie et de son hôte permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors de l’infection. Enfin, ce projet permettra de mieux évaluer le degré de virulence de différentes espèces pathogènes ou de certaines souches cliniques. Ceci permettra de mettre en place des outils moléculaires pour la détection rapide de souches plus virulentes chez les patients. .
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
L’infection se fera par injection intra-péritoneale d’une solution de bactéries dans l’animal (10 min). Le sang pourra aussi être prélevé par ponction cardiaque immédiatement après la mise à mort de l’animal (
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les animaux infectés par des souches virulentes présentent habituellement des signes caractéristiques à partir de J5 après l’infection (le délai peut -être plus long en fonction de la dose injectée ou de la nature de la souche de leptospires utilisée), notamment perte d’activité, prostration, poils hérissés et perte de poids.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Les animaux utilisés lors des expériences seront mis à mort par inhalation de CO2. Ces animaux qui sont infectés avec des souches de leptospires potentiellement virulentes ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
La virulence des leptospires est très probablement multifactorielle (mobilité flagellaire, adhésion aux cellules, résistance aux stress, production d’hémolysines, reconnaissance de la surface des leptospires par le système immunitaire, etc) et seul l’animal permet d’étudier l’ensemble de ces mécanismes et leurs rôles au cours de l’infection. Cependant, pour l’étude de certains phénotypes comme l’adhésion des bactéries aux cellules de l’hôte, nous avons maintenant mis en place un modèle de cultures de lignées cellulaires afin d’étudier les interactions bactéries-cellules de l’hôte (notamment la capacité des leptospires à adhérer aux cellules et à traverser une couche monocellulaire). Des collaborations sont aussi envisagées pour utiliser ces modèles. Cependant, aucun modèle autre que celui des animaux existe pour l’étude de la virulence.
2. Réduction
On procèdera tout d’abord à une sélection rigoureuse des souches à tester dans les modèles animaux. Pour l’étude de la virulence d’un mutant (principale activité de l’unité), on ne sélectionnera que les mutants présentant une forte probabilité d’être atténués dans leur virulence (analyse du gène inactivé, étude préalable du phénotype du mutant in vitro, etc). On pourra regrouper le nombre de mutants à tester afin de le comparer à un seul groupe contrôle. Dans le cadre de l’analyse de la charge bactérienne, du transcriptome ou de la réponse immunitaire au cours de l’infection, on limitera les points de prélèvements à la phase précoce (J1 post-infection) et à la phase tardive (J3 et/ ou J6 post-infection).
3. Raffinement
A réception, les animaux resteront en cage 1 semaine avant toute intervention pour une bonne acclimatation. Les cages seront enrichies avec de l’aliment sous forme de gel, des cylindres en plastique et du coton. On pourra utiliser les chaufferettes et pratiquer la réhydratation sc avec le sérum physiologique. Une infection par les leptospires pathogènes entraîne chez les animaux sensibles (gerbilles, hamsters, cobayes) une prostration et les poils hérissés. Pendant la période de l’infection aigue chez l’animal (pour l’inoculation de 10e4-10e6 bactéries, la mortalité est maximale entre les jours 5 et 9 après l’infection), on procédera à deux visites dans la journée (matin et après-midi), y compris les week-ends et jours fériés, afin d’observer tous signes extérieurs (poils hérissés et prostration). Pour certaines souches virulentes, une perte de poids avant la mort (une perte de 10% de poids chez le hamster indique une leptospirose avancée et irréversible) est aussi observée. Dans ce cas, les animaux sont pesés quotidiennement. Les animaux moribonds seront mis à mort.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Cobaye, Gerbille et/ou Hamster : seuls ces animaux sont capables de développer la maladie avec des signes cliniques proches de la pathologie humaine, en particulier avec atteinte des organes tels que le foie, le rein et les poumons. L’inoculation de souches virulentes chez ces animaux par voie intra-peritonéale entraîne la mort des animaux infectés. L’application de points limites permettra de limiter la douleur. Pour les cobayes et hamsters, on privilégiera l’utilisation d’animaux âgés de 4 semaines; des animaux plus âgés peuvent être plus résistants à l’infection (maturité du système immunitaire). Ce n’est pas le cas pour les gerbilles, on pourra donc utiliser des gerbilles jeunes ou adultes.