Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 06/02/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-807798)
Jusqu’à vingt injections par animal réparties sur douze semaines, dont l’injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le poumon : 298 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Toutes sont tuées pour prélèvement de tissus, le porteur écartant toute réutilisation au motif qu’elle introduirait une variabilité indésirable. Le projet cherche à établir qu’un défaut du gène de la mucoviscidose augmente l’incidence des cancers, en passant par un modèle transgénique où ce gène est invalidé dans les vaisseaux. Cent souriceaux âgés de 1 à 14 jours sont inclus pour l’étude de la rétine. Le laboratoire indique disposer de sphéroïdes, de puces microfluidiques et de cellules de patients qui lui permettent de se passer d’animaux pour la majorité de ses expériences, et juge malgré tout l’approche sur « organisme entier » nécessaire pour suivre la formation des tumeurs.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci des atteintes cardiovasculaires et un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. Ce risque élevé est également retrouvé pour d’autres entités tumorales comme le cancer pulmonaire. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise, et le compartiment vasculaire pourrait avoir un rôle important. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées ou intrapulmonaires de cellules tumorales (1 seule injection par animal), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 10 semaines ou 1 injection journalière pendant 2 semaines). Il n’y aura jamais plus qu’une injection par jour par animal. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d’un maximum de 20 injections par animal réparties sur 12 semaines.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (1 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 6ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l’établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes multicellulaires, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l’utilisation d’animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L’approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexes et sur le long terme comme la tumorigénèse.
2. Réduction
Les effectifs utilisés dans les procédures ci-dessous sont calculés avec le logiciel G*Power. Toutes les données seront ensuite analysées avec les logiciels R et GraphPad Prism. Notre projet nécessitera 298 animaux au total, et sera décomposé en 7 procédures. La procédure #1 sera reproduite sur des rétines à P14 uniquement si les résultats indiquent une angiogenèse modifiée chez les animaux mutées à P6. Pour cela nous aurons besoin, au maximum, de 20 portées de 5 souriceaux soit environ 33 souriceaux Cftrlox/lox – CDH5creERT2 (mutés), 33 souriceaux Cftrwt/lox – CDH5creERT2 (hétérozygotes), et 34 souriceaux Cftrlox/lox (contrôles). Ce second temps nous permettra d’établir si le défaut d’angiogenèse est temporaire ou permanent. Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Procédure #1 : 2 groupes test de 33 souris, et 1 groupe contrôle de 34 souris : soit 100 animaux total. Procédure #2 : 3 groupes test de 10 souris, et 3 groupes contrôles de 4 souris : soit 42 animaux total. Procédure #3 : 2 groupes test de 10 souris, et 1 groupe contrôle de 10 souris : soit 30 animaux total. Procédure #4 : 3 groupes test de 10 souris, et 6 groupes contrôle de 10 souris : soit 90 animaux total. Procédure #5 : 2 groupes test de 12 souris, et 1 groupe contrôle de 12 souris : soit 36 animaux total.
3. Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : – Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) – Faciès contracté et position anormale des vibrisses – Yeux clos et larmoyant – Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs – Fèces liquides ou absence de fèces. – Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques des Procédures #2 et #3). •Critères comportementaux : – Position recourbée (dos voûté, prostration) – Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) – Réduction de l’activité, isolement – Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : – Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement vasculaire et tumoral. Nos précédents travaux publiés ont mis en lumière des défaut vasculaires et une inflammation accrue dans les poumons et foie de modèle de souris atteintes de mucoviscidose, ce qui pourraient expliquer l’apparition de cancers à long terme chez les patients. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris transgénique permettant une invalidation de Cftr dans le compartiment vasculaire nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des nouveaux nés âgés de P1 à P14 (post naissance), et des souris adultes (6 à 8 semaines). Le stade de développement est justifié par la nécessité d’observer des phénomènes de développement vasculaire embryonnaire, et d’avoir des animaux adultes avec un système immunitaire mature (nécessaire pour l’influence tumorale).