Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 11/01/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-812109)
394 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour rechercher l’existence de cellules productrices de sang dans l’aorte adulte. Une partie est irradiée, ce qui provoque une aplasie médullaire et une immunosuppression, puis greffée avec de la moelle et soumise à des injections répétées, les animaux dont le greffon échoue étant tués par dislocation cervicale. Lorsque la maladie du sang apparaît vers six mois, le porteur prévoit un prélèvement sanguin maximal auquel les souris ne peuvent survivre, suivi de la mise à mort. Il indique que des essais in vitro sur cellules humaines n’ont pas reproduit le phénomène et affirme que « seules des expériences chez l’animal » le permettront.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
A l’âge adulte, les cellules sanguines sont produites dans la moelle osseuse, au cours du processus appelé « hématopoièse ». Les cellules souches hématopoïétiques sont donc un réservoir de cellules sanguines et pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment. Il est actuellement établi que les cellules souches hématopoïétiques présentes à l’âge adulte ont été produites très tôt, pendant un laps de temps très court, au cours de la vie embryonnaire ; de façon étonnante, les cellules qui produisent les cellule souches hématopoïétiques sont des cellules de la paroi de l’aorte, appelées cellules endothéliales « hémogéniques ». Il semble que ces cellules endothéliales hémogéniques n’existent pas uniquement chez le jeune embryon mais aussi chez le jeune animal. Cependant, à l’heure actuelle, aucune équipe n’a rapporté l’existence de telles cellules à l’âge adulte. Ces dernières années, notre équipe a étudié le rôle des cellules endothéliales adultes dans la formation de caillots sanguins. Nous nous sommes notamment intéressés aux cellules endothéliales mutées pour la protéine d’intéret. Cette protéïne activatrice de la mutation est très fréquemment retrouvée dans des maladies hématologiques, les néoplasies myéloprolifératives; nous avons créé deux modèles de souris au sein desquels, théoriquement, uniquement les cellules endothéliales adultes portent la mutation. Nous avons eu la surprise d’observer que certaines de ces souris développaient une maladie du sang, avec des cellules souches hématopoïétiques avec la présence de cette protéïne. Ces résultats suggèrent donc qu’il existerait, dans ces modèles murins, des cellules endothéliales hémogéniques. Notre projet de recherche vise à démontrer formellement l’existence de cellules endothéliales hémogéniques dans ces souris adultes. Si nous confirmons la présence de cellules endothéliales hémogéniques avec cette protéïne dans ces souris, nous chercherons à les isoler et les caractériser (marqueurs, profil d’expression génique).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
La recherche sur les cellules souches hématopoïétiques est très active car non seulement elle est utile pour mieux comprendre (et traiter) des maladies hématologiques comme les leucémies, mais elle est aussi très utile pour envisager la production de cellules sanguines matures, qui pourraient servir pour des transfusions et ainsi s’affranchir des besoins réguliers en dons du sang (avec les risques inhérents aux transfusions sanguines). Mieux comprendre d’où viennent les cellules souches hématopoïétiques est donc un enjeu scientifique majeur, comme en attestent les fréquentes publications dans des journaux renommés. De nombreux efforts ont été faits ces dernières années pour tenter d’amplifier les cellules souches, sans qu’elles ne se différencient (car une fois qu’elles se différencient, elles perdent leur capacité à produire toutes les lignées sanguines et ne s’auto-renouvellent plus). L’avènement des IPS (Induced Pluripotent Stem cell) a susicté des espoirs pour arriver à reprogrammer des cellules matures en IPS et les faire ensuite se différencier en cellules souches hématopoïétiques. Mais malgré des efforts colossaux, aucun laboratoire n’a réussi à obtenir, à partir des IPS, de réelles cellules souches hématopoïétiques. Il n’y a donc à l’heure actuelle, aucune stratégie disponible pour produire de nouvelles cellules souches hématopoïétiques adultes. Ici, nous avons pour objectif de mettre en évidence des cellules endothéliales adultes, capables de fabriquer de nouvelles cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques étant un réservoir de cellules sanguines, pouvoir contrôler leur nombre ou leur fonction pourrait permettre des avancées thérapeutiques pour les greffes notamment.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Lot 1 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d’une durée de 20s par souris, plus 40 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 2 : 6 souris donneuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d’une durée de 20s par souris, plus 6 donneuses avec administration par gavage en une seule dose (durée de l’intervention 20s par souris), plus 80 souris receveuses avec 1 seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 20s par souris). Lot 3 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d’une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 4 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d’une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 5 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d’une durée de 20s par souris, plus 1 seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 6 : 40 souris receveuses avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 2 x 5 jours (10jours), soit 10 interventions d’une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 7 : 20 souris receveuses avec une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 8 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d’une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 9 : 20 souris avec injection intrapéritonéale 1/jour pendant 5 jours soit 5 interventions d’une durée de 20s par souris, plus une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris). Lot 10 : 10 souris avec une seule injection intraveineuse (durée de l’intervention 1min30 par souris).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
L’aplasie médullaire et l’immunosuppression induites par l’irradiation constituent des effets dommageables sur l’animal. Nous resterons donc très vigilent les jours qui suivent l’irradaition. 24h après, les souris receveuses recevront en IV des cellules de moelle de souris donneuses. Pour les souris dont le greffon prendra bien, nous observerons dans la première semaine une perte de poids ne dépassant pas les 10%. Dans la deuxième semaine ces souris retrouveront un poids normal puis poursuivront leurs croissances pour le restant de l’étude. Pour les souris dont le greffon ne prendra pas, nous observerons une perte de poids d’environ 10% dans la première semaine qui se poursuivra dans la deuxième. Ces animaux seront alors mise à mort par dislocation cervicale.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Lorsque que la maladie hématologique apparaitra vers 6 mois, un maximum de sang sera prélevé sur les animaux pour analyses. Les animaux ne pouvant survivre à un tel prélèvement, ils seront ensuite tous mis à mort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous avons réalisé des études in vitro, à partir de cellules endothéliales humaines (HUVEC) exprimant la mutation. Nous n’avons pas observé de phénotype hémogénique dans ces cellules, ni d’expression de facteurs de transcription laissant penser qu’elles devenaient hémogéniques. Ces résultats ne sont pas surprenants car il était peu probable que Ia seule présence que la mutation dans n’importe quelle cellule endothéliale la rende hémogénique. Les HUVEC sont des cellules endothéliales provenant de cordon ombilical et donc pourtant assez jeunes et les plus « proches » possibles des cellules endothéliales embryonnaires. Il est probable que ce phénotype hémogénique ne soit conféré qu’à de très rares cellules endothéliales. Seules des experiences chez l’animal, permettant, l’expression de la mutation dans toutes les cellules endothéliales, nous permettra de voir quelle sous population de cellules endothéliales portant cette mutation est devenue hémogénique.
2. Réduction
Le nombre maximum d’animaux nécessaire à cette étude a été calculé à 394. 20 animaux dans chaque groupe expérimental et par expérience seront utilisés afin d’obtenir un résultat statistique cohérent. Les analyses statistiques des résultats seront réalisées avec le test adéquats. Ce nombre peut paraitre elevé, mais est necessaire compte tenu du fait que nous cherchons à greffer des cellules souches qui sont très rares dans les moelles qui servent de greffon. Ainsi, si nous voulons avoir des résultats scientifiquement valides, reproductibles et qui nous permettent d’estimer une fréquence de cellules souches, nous avons besoin de 20 animaux par lot.
3. Raffinement
L’hébergement des animaux permet de reduire le stress et l’inconfort : animalerie agrée, personnels formés, cages de 6 animaux maximum en portoirs ventilés avec libre accès à l’eau et la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cortonné de carré de cellulose. Les animaux recevront systématiquement un antalgique 30 min avant l’anesthésie lors des administrations intraveineuse et des prélèvements sanguins et seront placé sur un tapis chauffant. Les anesthésies seront réalisées à l’aide d’un poste automatisé distrubuant un gaz anestésiant. Les animaux seront tout d’abord placés dans la boite pour induire l’anesthésie jusqu’à un endormissement profond puis seront transférés sous masque individuel pour réaliser administrations et prélèvements. Pour éviter les risques d’infection suite à l’irradiation, des précautions seront mise en place. Tout d’abord, nous transporterons (3 minutes) la boite d’irradiation avec les souris dans un sac isotherme décontaminé. De retour au laboratoire, elles seront transférées dans leurs cages d’hébergements pour portoirs ventilés qui auront été préalablement stérilisées par autoclavage avec litière et enrichissement. Les biberons et l’eau de boisson seront également stérilisés par autoclavage. Nous distribuerons à ces souris un aliment stérilisé par le fournisseur. Ces transferts seront réalisés sous une hotte perméttant de maintenir la stérilité de l’environnement des souris. Notre animalerie est de statut conventionnel, une attention toute particulaire sera apportée à ces cages. Durant la première semaine après la greffe une visite quotidienne sera nécessaire pour évaluer le bien-être des animaux à l’aide d’une grille d’Observations/Actions qui nous permettra d’identifier les points limites et d’apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
La souris a été choisie comme modèle d’étude en raison de l’existence de souris transgéniques dont les gènes d’intérêt ont été mutés. Nous disposons dans notre laboratoire de différentes lignées de souris transgéniques mutées au niveau d’une ou plusieurs lignées de cellules hématopoïétiques. C’est un modèle de mammifère à sang chaud dont l’organisation structurale du réseau vasculaire et sanguin à de forte ressemblance avec l’homme. Pour toutes ces manip, les souris auront entre 16 et 18 semaines, qui est l’âge de l’apparition de la maladie. Les C57Bl6 seront entre 10 et 12 semaines, âge adulte de la souris où la formule sanguine et les composants du sang sont bien équilibrés et stables.