Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 16/05/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-828521)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La NF1 est une maladie génétique qui affecte 1 sur 3000 naissances. Le gène responsable de cette maladie est nommé Nf1. C’est un gène suppresseur de tumeur qui ne fonctionne plus en raison d’une mutation. Il commande la fabrication d’une protéine : la neurofibromine. En l’absence de cette protéine (lorsque le gène Nf1 est muté), des tumeurs le plus souvent bégnines se développent. Tous les patients NF1, hommes et femmes, développent des neurofibromes cutanés (NFc), des tumeurs bégnines qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses dans la peau. Les NFc, apparaissent généralement à partir de la puberté et leur nombre et taille ne cesse d’augmenter avec l’âge, de sorte que les patients peuvent en développer des milliers. Les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc restent mal connus. Le rôle de l’innervation dans leur développement n’a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d’interaction entre les nerfs et leur microenvironnement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d’autres atteintes cutanées comme le psoriasis et la dermatite atopique. Le but de ce projet est d’explorer l’hypothèse selon laquelle l’innervation cutanée contrôle le développement des NFc. Pour cela nous utiliseront le modèle murin de NF1 (NF1-KO) qui développe des NFc avec pour objectif de proposer des nouveaux traitements ciblant l’innervation des NFc.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les mécanismes qui gouvernent le développement de NFc restent mal connus. Le rôle de l’innervation dans leur développement n’a jamais été exploré et constitue une nouvelle piste mécanistique et thérapeutique. Enfin, une meilleure compréhension des mécanismes d’intéraction entre les nerfs et leur microenvironement immunitaire dans la peau permettra de mieux comprendre la pathophysiologie d’autres atteintes cutanés comme le psoriasis et la dermatite atopique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Dépôt local des vecteurs viraux pour tracer l’innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min pour le dépôt + 45 min d’absorption de l’adénovirus par souris (total de 1h15 par souris), 6 dépôts par souris, sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 (3, 4 et 5, selon le mode d’injection choisi lors de la procédure 2) : Injection intradermique locale des vecteurs viraux pour tracer l’innervation et pour éliminer les neurones qui innervent les neurofibromes, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 injections par souris, 6 x 2 (12) injections par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 4 : Dénervation cutanée locale des neurones sensoriels d’origine pharmacologique, utilisée pour étudier l’innervation sensorielle de peau sans pour autant induire de phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 30 min d’injection par souris, 6 x 2 (12) injections intradermiques par souris (6 au jour 1 et 6 au jour 2), sous anesthésie générale. Procédure 5 : Dénervation cutanée globale des neurones sympathiques d’origine pharmacologique, utilisée pour étudier l’innervation sympathique de peau sans pour autant d’induire des phénomènes douloureux, durée de l’intervention : 20 min d’injection par souris, 1 x 3 (3) injections intrapéritonéales par souris (1 au jour 1, 1 au jour 2 et 1 au jour 3), sous anesthésie générale. Procédures 2, 3, 4 et 5 : Suivi du développement des NFc sous la lampe à épifluorescence : 20 min pour raser, épiler et prendre une photo du dos de la souris, 2 fois par semaine pendant la durée du suivi, sous anesthésie générale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Aucun effet nusible ou indésirable n’est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. De plus, les NFc développés par les souris de notre modèle d’étude sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois et jusqu’à 6 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de chaque expérience tous les animaux seront mis à mort par injection létale de Dolethal, puis la peau disséquée et analysée.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc et permettant d’étudier leur innervation.
2. Réduction
Pour la Réduction ; cette étude, de par sa nouveauté, nécessite des mises au point. Nous estimons que 20 souris adultes seront nécessaire pour la procédure expérimentale 2 ce qui permettra, par la suite, de réduire le nombre total d’animaux inclus dans ce projet. Ce nombre de 20 souris a été defini afin de mettre au point le mode d’injection (injection intradermique : ID ou transcutanée : T), le temps de diffusion (2 ou 3 semaines) et le type de virus utilisé (virus sans tropisme : ST ou avec tropisme axonal : TA). Nous possédons déjà une grande expertise d’analyse cellulaire et moléculaire des NFc et de manipulation des nerfs périphériques (microdissections, injections des vecteurs d’expression et des colorants). Pour la procédure expérimentale 4, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point, ce nombre plus faible que pour la partie précédente est lié au fait que la technique utilisée d’ablation des nerfs sensoriels à l’aide de la résinifératoxine est un modèle efficace et bien documenté dans la littérature. De la même facon et pour les mêmes raisons, 12 souris seront nécessaires pour effectuer les mises au point de la procédure expérimentale 5. Nous estimons la reproductibilité des résultats avec les techniques des procédures expérimentales 4 et 5 à 80% donc nous attendons un groupe de 9-10 animaux pour etre analysé.
3. Raffinement
Pour le Raffinement ; nous considérons qu’une fois les mises au point validés, les variations liées à l’expérimentateur et la méthodologie seront faibles (+/- 5%) ce qui conduira a une reproductibilité des resultats d’environ 95% . Nous surveillerons régulièrement l’état de santé des animaux afin de déceler tout signe de souffrance avérée et si tel est le cas nous effectuerons une mise à mort compassionnelle. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients NF1, les souris de notre modèle d’étude NF1-KO développent des NFc dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’œil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. A la suite de chaque procédure impliquant une anesthésie générale, les souris endormies seront gardées seules dans une cage propre séparée jusqu’à leur réveil.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons récemment concu le modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des NFc (NF1-KO) et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et leur innervation Animaux adultes agés entre 2-6 mois. Le developpement des NFc a lieu pendant cette période.