Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-06-24 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-850737)
Une constriction du nerf sciatique sous anesthésie, une injection d’adjuvant de Freund dans le coussinet plantaire, des plaques à 4 et à 55 degrés, huit séries de filaments de von Frey : les procédures de ce projet consistent à provoquer de la douleur puis à la mesurer. 342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue pour analyses cellulaires et moléculaires. Le porteur indique que l’injection dans la patte peut entraîner des douleurs modérées et persistantes, des difficultés à se mouvoir et des automutilations, et que la chirurgie s’accompagne de risques de destruction des sutures, de cannibalisme et de décès au réveil. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré pour l’ensemble, alors que le protocole retient la constriction du nerf sciatique comme le modèle admis des douleurs neuropathiques chroniques chez l’être humain.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le projet vise à établir le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans la perception de la douleur chez la souris. Les Treg sont des cellules supprimant la réponse immunitaire. Ils sont donc bénéifiques dans les maladies auto immunes mais nuisibles dans le cancer. Notre hypothèse est que les lymphocytes T régulateurs masquent la douleur directement de par leur capacité à sécréter des analgésiques naturels. Nous utiliserons des lignées de souris mutantes et des tests de sensibilité à la douleur dans différentes conditions inflammatoires et non inflammatoires. Nous évaluerons particulièrement la douleur ressentie dans un modèle de cancer, dans un modèle de chimiothérapie et dans un modèle inflammatoire induit. Nous évaluerons aussi le rôle des Treg dans la douleur dans un modèle de chirurgie du nerf sciatique, le modèle communément admis de douleurs neuropathiques chroniques chez l’homme. Nous mesurerons l’intensité de la douleur percue par stimulation mécanique ou par des observations comportementales. L’ensemble des résultats de ce projet permettra de proposer un nouveau mécanisme de régulation de la douleur chez la souris avec de possibles implications cliniques chez l’homme.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Les patients atteints de cancer et traités par chimiothérapie souffrent souvent d’une sensibilité thermique altérée. Notre projet va permettre de préciser les mécanismes associés afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Tous les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales sur animal vigile, nécessaire à l’induction des modèles génétiquement modifiés à raison de cinq injections à un jour d’intervalle (moins d’une minute/injection). Une première partie des animaux seront impliqués dans une injection unique dans le coussinet plantaire effectuée sous anesthésie générale gazeuse (environ 5 minutes). Une deuxième partie des animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales effectuée sous anesthésie gé nérale gazeuse (environ 5 minutes). Une troisième partie des animaux seront impliqués dans une unique chirurgie de constriction du nerf sciatique ischio-jambier (environ 30 minutes) effectuée sous anesthésie et analgésie pré et post-opératoire. La sensibilité à la douleur sera mesurée à l’aide d’un test de référence (filaments Von Frey) à raison de 8 mesures de 3 à 9 jours d’intervalles (environ 60 minutes). Enfin, une quatrième partie des animaux seront impliqués dans une injection unique voie intrapéritonéale d’une molécule d’intérêt (environ 1 minute) et la sensibilité́ thermique sera mesurée à l’aide de test de référence en exposant les animaux sur une courte durée sur un plaque au froid (4 degrés) et au chaud (55 degrés) et en mesure le temps de retrait (maximum 1 minute/animal). Ce test sera effectué 4 fois avant et après l’induction du modèle génétiquement modifié. A l’issue de ces actes, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et des analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Les injections intra péritonéales entrainent une douleur légère et brève, L’injection d’adjuvant complet de Freund dans la patte est susceptible d’entrainer douleurs modérées mais persistantes, difficultés à se mouvoir et auto-mutilations. Les animaux sont opérés avec une chirurgie invasive, entrainant une douleur modérée. Il existe des risques infectieux suite à la chirugie. Le comportement des souris peut être altéré suite à l’anesthésie et à la chirurgie. Des comportements aggressifs peuvent apparaitre avec destructions de sutures et cannibalisme. L’anesthésie en tant que telle présente des risques tels que hypothermie, difficultés respiratoires pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardiaque. Le réveil de l’anesthésie est une étape critique avec un risque certain de décès. La croissance des tumeurs en sous cutanée pourrait entrainer douleurs et perte de poids liées soit à la croissance de la tumeur localement, soit à la dissémination métastatique de la tumeur. Les tests thermiques peuvent entrainer une douleur légère à modérée, objet de l’étude.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Selon la définition de la Douleur par l’Association Internationale de l’Etude de la douleur (1979), » La douleur est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à un dommage tissulaire présent ou potentiel, ou décrite en terme d’un tel dommage. « , on perçoit le caractère pluridimensionnel et plurifactoriel de la notion de douleur. Au regard de notre thématique faisant appel à des mesures de variation de la nociception, il nous est par conséquent impossible de palier à l’utilisation d’animaux vivants (anesthésiés ou vigiles). Notre projet est basé sur la perception de la douleur chez l’animal sans possibilité de remplacement par des expérimentations in vitro, la douleur n’étant pas quantifiable par des paramètres biochimiques connus.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum (342) sans compromettre la validité statistique des analyses des résultats. Après calculs, nous avons établi que 6 animaux par groupe dans 3 expériences indépendantes assurait la fiabiité statistique des résultats. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est aussi de réaliser les expériences sur les deux lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin de les comparer au même groupe témoin.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
L’état général des animaux sera suivi de manière journalière par le personnel qualifié de l’animalerie ou par les membres habilités de l’équipe. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du carton pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l’installation d’une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine avant leur inclusion dans les protocoles. Les animaux sont anesthésiés durant les procédures pouvant engendrer de la souffrance. Les animaux entrant dans le cadre d’une chirurgie seront traités avec des analgésiques/anti-inflammatoires avant et après la chirurgie.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
La souris et le rat sont les espèces animales utilisées depuis de nombreuses années pour ce type d’étude. La souris représente un très bon modèle pour réaliser des expériences de comportement, des études de neuroanatomie, de physiologie et de biologie cellulaire et moléculaire. En outre le choix des rongeurs dans les études portant sur la douleur est admis depuis de nombreuses années et les modèles expérimentaux de douleurs chroniques sont bien caractérisés tant du point de vue des études comportementales que des analyses cellulaires ou moléculaires. La disponiblité de souris génétiquement manipulées pour les gènes d’intérêt rend aussi l’utilisation de cette espèce indispensable à la réalisation de ce projet. Dans ce projet 3 lignées différentes de souris génétiquement modifiées seront utilisées. Ces animaux sont issus d’élevage réalisés dans notre animalerie. Des souris de 8 à 12 semaines d’âge seront utilisées pour travailler avec un système immunitaire mature. De plus, des souris adultes résistent mieux à l’anesthésie, ce qui garantit un réveil rapide et sans séquelles.