Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-868881)
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections rétro-orbitaires reproduisant un purpura thrombotique, avec perte de poids attendue, puis subissent des prélèvements sanguins avant d’être tuées par dislocation cervicale pour prélever sang et organes. Le porteur indique développer en parallèle des modèles cellulaires à partir de plasma humain. Il affirme néanmoins que ces procédures ont un caractère de « stricte nécessité » et ne peuvent être remplacées.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le purpura thrombotique thrombocytopénique acquis (PTT) est une maladie rare et grave, touchant le plus souvent l’adulte jeune. Les manifestations de cette pathologie sont une baisse du nombre de plaquettes, une anémie hémolytique, et une souffrance brutale d’un ou plusieurs organes. Cette pathologie est souvent chronique, évoluant sur un mode de poussées entrecoupées de rémissions. Malgré la prise en charge actuelle (échanges plasmatiques, anticorps thérapeutiques), 20% des patients décèdent. Cette maladie est secondaire à un déficit en une enzyme (ADAMTS13), qui est l’enzyme physiologiquement responsable du clivage de grands assemblages protéiques de facteur de Von Willebrand » (VWF). Ce sont sur ces « filaments collants », qui ne peuvent pas être coupés par l’ADAMTS13 déficitaire, que les plaquettes circulantes viennent s’agréger, obturant ainsi les petits vaisseaux. Les microthrombi ainsi créés empêchent les tissus en aval d’être perfusés en oxygène, générant ainsi des lésions ischémiques touchant notamment le cœur et les reins. L’anémie hémolytique microangiopathique comprend la fragmentation des globules rouges causée par une lésion microvasculaire ainsi que par des dispositifs mécaniques. L’anémie hémolytique mécanique a pour conséquence une élévation des concentrations d’hème dans les plasmas de patients PTT. L’hème est un cofacteur essentiel de l’hémoglobine présente normalement dans les globules rouges. Une concentration élevée d’hème libre dans la circulation est connue pour avoir une cytotoxicité élevée et provoquer des dysfonctions rénales Récemment, il a été montré qu’AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) protégeait de la dysfonction rénale induite par l’hème dans un modèle murin de paludisme. AhR est un facteur de transcription activé par la fixation de ligand. Il est notamment connu pour son rôle dans la détoxification de ligands environnementaux. L’implication de ligands endogènes dans l’activation d’AhR a montré qu’il joue un rôle dans le contrôle de nombreuses fonctions physiologiques telles que le développement, le cycle cellulaire et la réponse immuno-inflammatoire. Parmi les nouveaux ligands identifiés, des métabolites de l’hème (bilirubine et biliverdine) sont des agonistes d’AhR.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ces modèles animaux sont des outils importants pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant un PTT.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à 3 injections rétro-orbitaires (J0, J1, J2) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Ces injections seront espacées de 24h et le volume injecté sera inférieur à 100 µL. Il seront soumis à 2 prélèvements sanguins ((J0 et J3) par ponction de la veine mandibulaire (50 µl) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). A J6, ils recevront une injection en sous cutané d’un analgésique (buprénorphine 0.1 mg/kg) 30 min avant le prélèvements cardiaque sous anesthésie générale (sevoflurane 5%) puis ils seront euthanasiés par dilocation cervicale. Les injections et les prélèvements sanguins durerons quelques secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables attendus sont liés au modèle d’induction du PTT par injection de vWF. Chez ces souris, nous nous attendons à oberver une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux de la procédure 1 seront gardés en vie et utilisés dans la procédures n°2. Ils seront tous euthanasiés, a lissue de la procédure 2 par dislocation cervicale, sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Il est nécessaire d’euthanasier ces animaux afin de prélever le sang et les différents organes et d’anaylser le rôle d’AhR sur la sévérité du PTT par rapport à des critères biologiques, histologiques et d’expression génique.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
A chaque fois que cela sera possible, des modèles in vitro seront développés. Des modèles cellulaires et des plasmas humains provenant de sujets atteints de PTT seront utilisés pour décrire les mécanismes cellulaires qui sont modifiés au cours de la maladie. Les procédures auront un caractère de stricte nécessité et ne pourront pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information.
2. Réduction
Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d’un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d’animaux nécessaire et suffisant à l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Au cours du design de ce projet, nous avons choisi le nombre minimal d’animaux par groupe. Le calcul d’effectif est déterminé a priori afin de garantir la puissance statistique des paramètres étudiés. Pour cela, nous avons utilisé le logiciel anastats disponible sur www. Anastats.fr. Afin de réduire le nombre d’animaux, le partage d’organes ou de tissus d’animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du C2VN et des équipes qui collaborent avec l’unité sur la thématique du PTT.
3. Raffinement
les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. L’état moribond de l’animal et la mort seront évités en tant que point limite. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites et des mesures seront prises pour les soulager en se basant sur l’évaluation de l’état d’un animal (poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Au moyen d’une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), nous déterminerons un score et agirons en conséquence (analgésie voire arrêt de l’expérimentation par euthanasie de l’animal). Les animaux seront hébergés par groupes de 6 individus par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de matériaux de nidification de type « Nestlets ».
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le plus utilisé pour générer un KO. Les modèles de souris KO pour AhR et ADAMTS13 sont largement utilisés pour étudier le rôle précis de ces molécules et pour la deuxième lignée, d’étudier le PTT (purpura thrombotique thrombocytopénique). Ils sont déja disponibles à l’animalerie du CEFOS et à l’animalerie de la faculté de pharmacie. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 10 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle) soit révolue.