Rôle des mécanismes de sélection compétitifs dans la voie asymétrique chez les larves de poisson zèbre

Une bonne réponse aux situations stressantes est essentielle pour la survie. Face à des menaces, les animaux ont tendance à réagir de manière automatique : ils fuient ou se figent sur place, avant de revenir à une activité normale. Ces comportements ne peuvent pas être réalisés en même temps, mais se produisent successivement. Si ces réactions sont mal adaptées, cela peut entraîner des troubles comme la dépression, l’anxiété ou la dépendance chez l’homme. Bien que les scientifiques aient déjà repéré des zones du cerveau impliquées dans ces comportements, il reste difficile de comprendre précisément pourquoi certaines régions s’activent plutôt que d’autres. Une zone spécifique, appelée le noyau habénulointerpédonculaire (Hb-IPN), est particulièrement importante pour les réponses liées à la peur et au stress. Cette zone fonctionne grâce à deux circuits opposés qui se régulent mutuellement : quand l’un est activé par un stimulus négatif, l’autre est inhibé. En utilisant les larves de poisson zèbre, dont le cerveau est transparent et facile à observer, ce projet cherche à mieux comprendre comment une structure asymétrique du cerveau gère les informations provenant de l’extérieur et influence nos réactions face au stress.

Les troubles mentaux, comme la dépression, l’anxiété, le syndrome de stress post-traumatique ou la toxicomanie, représentent un problème de santé majeur. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), une personne sur cinq en France sera touchée par l’un de ces troubles au cours de sa vie. Pourtant, on comprend encore mal ce qui déclenche ces troubles et comment ils se développent. En outre, les traitements actuels sont souvent peu efficaces, surtout pour plus de la moitié des patients. Ces troubles mentaux sont liés à un dérèglement des comportements de réaction au stress, qui sont des réponses physiques et émotionnelles aux stimuli extérieurs. Avant de pouvoir trouver de meilleurs traitements, il est essentiel de comprendre comment ces réactions se mettent en place, au niveau biologique et moléculaire. Ce projet se concentre sur une zone particulière du cerveau, appelée la voie Hb-IPN, qui est impliquée dans les réactions à la peur et au stress. Bien qu’elle soit présente chez de nombreuses espèces, cette zone reste peu étudiée. Grâce à des techniques modernes, nous cherchons à comprendre comment les deux circuits principaux de cette voie fonctionnent et interagissent pour moduler les réponses physiques face à des situations stressantes. L’objectif est de mieux comprendre comment cette voie influence les comportements liés au stress, à l’anxiété ou à la dépendance, comme celle à la nicotine. Ce travail pourrait permettre de découvrir de nouvelles cibles pour des médicaments plus efficaces contre ces troubles. La voie Hb-IPN contient des récepteurs qui réagissent à certaines substances chimiques. En étudiant ces récepteurs, nous pourrions identifier de nouveaux composés capables de modifier leur activité. L’utilisation du poisson zèbre pour la recherche de médicaments a déjà montré son efficacité. À long terme, notre projet pourrait contribuer à trouver de nouvelles molécules qui aideraient à soulager les symptômes de troubles mentaux, tels que le stress post-traumatique ou l’anxiété.

150 poissons zèbres seront soumis à une seule collecte de sperme par individu de manière non invasive et sous anesthésie pour préserver la lignée. L’ensemble de la procédure ne dépassera pas 3 minutes hors de l’eau. Pour identifier le génotype des 800 poissons adultes issus de la génération de nouvelles lignées, nous réaliserons une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. La nageoire servira à extraire l’ADN utilisé pour le génotypage. C’est la méthode la moins invasive pour génotyper les poissons. Cette procédure ne dépasse pas 20 secondes par individu et n’est réalisée qu’une fois dans la vie de l’animal. Les procédures suivantes seront réalisées sur des larves âgées de 5 à 7 jours. Afin d’enregistrer l’activité neuronale, nous réaliserons une imagerie calcique de larves transgéniques. Nous mesurerons d’abord l’activité spontanée des larves puis elles seront soumises à des tests pharmacologiques ou à un faible potentiel de champ électrique. Il s’agit d’une approche à haut débit qui réduit le temps de manipulation des poissons : la procédure est limitée à 30 minutes par larve. Les 5400 larves seront vigiles durant l’imagerie calcique. Pour modifier l’activité neuronale dans le cerveau, nous réaliserons des expériences pharmacologiques, soit par une application aiguë (30 min) soit par une application chronique (3 jours). L’expérience pharmacologique sera réalisée lors d’imagerie calcique (aiguë) ou de tests comportementaux (aigus ou chroniques). L’activité locomotrice sera enregistrée lors d’une activité spontanée (pas de stimulus externe), de changements de lumière (présence ou absence de lumière) ou d’applications de potentiels de champ électrique doux (10 minutes de base, application d’un faible potentiel de champ électrique, d’une durée inférieure à 100 millisecondes, 10 fois à 1 minute d’intervalle, 10 minutes de récupération). Ces tests ne dépasseront pas 3 heures. Les 5400 larves utilisées dans cette procédure seront vigiles.

Nous immobiliserons les larves dans un gel avec ou sans ajout d’un agent paralysant. Il s’agit d’une procédure de routine dans le domaine qui est nécessaire pour réaliser une séance d’’imagerie à l’aide d’un microscope (30 minutes maximum). Nous administrerons un léger champ électrique aux larves immobilisées pour effectuer une imagerie afin d’analyser leur activité́ cérébrale et les mouvements de la queue. Les animaux peuvent ressentir un certain inconfort dû à l’immobilisation. Le champ électrique sera délivré́ pendant une durée inférieure à 100 millisecondes. Les animaux peuvent ressentir une douleur comparable ou inferieure à celle d’une brève piqûre d’aiguille. Concernant les poissons adultes nous devrons les génotyper afin de savoir s’ils ont ou non la mutation désirée. Pour ce faire nous réaliserons sous anesthésie une biopsie de la nageoire caudale. Les animaux peuvent ressentir une douleur inférieure ou égale à celle occasionnée par une brève piqûre d’aiguille au réveil de l’anesthésie qui n’affecte en rien leurs capacités motrices. Ils seront par la suite placés dans des bacs d’hébergement individuel, ce qui peut occasionner un stress si ce mode d’hébergement dure trop longtemps. Le stress disparait aussitôt que les animaux sont remis en groupe d’au moins 2 individus.

Les animaux ayant été génotypés et/ou dont le sperme a été prélevé seront euthanasiés à la fin de la période de reproduction. Concernant les larves, elles sont euthanasiées à l’issue des procédures d’imagerie calcique et de comportement. Elles sont alors fixées pour une étude immunohistochimique

Le poisson zèbre (Danio rerio, zebrafish) est un modèle vertébré reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Il se développe rapidement et à l’extérieur de la mère, de sorte qu’il n’est pas nécessaire d’euthanasier la mère pour étudier son développement. Il pond un grand nombre d’œufs en même temps (jusqu’à 200 œufs) ce qui permet de réaliser de nombreuses expériences à la fois. Les embryons sont transparents permettant une visualisation aisée de l’activité neuronale et du développement cellulaire par l’expression de molécules fluorescentes spécifiques. Les embryons sont faciles à élever car ils se développent dans un incubateur à 28 degrés Celsius. Pour de nombreux projets, nous travaillons sur des embryons de moins de 5 jours, qui n’entrent pas dans le cadre de la réglementation sur l’expérimentation animale. Nous utilisons des embryons jusqu’à 7 jours, afin d’étudier la formation des synapses et l’activité neuronale dans une zone peu étudiée du cerveau appelée le système habénulo-interpédonculaire. Cette zone du cerveau est extrêmement difficile à étudier chez les rongeurs car elle est située en profondeur, alors que chez le poisson zèbre, elle se trouve à la surface même du cerveau.