Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 26/08/2024
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-897828)
Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale est immédiatement mise à mort, comme tout animal dont le score de bien-être ne s’améliore pas après 48 heures ou qui perd plus de 20 % de son poids. 476 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l’issue. 120 femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour déclencher une sur-ovulation, puis sont mises à mort entre 12 heures et 4 jours plus tard, dans une étude sur des variantes d’histones propres aux cellules reproductrices. Les autres sont tuées au titre de l’entretien de la colonie, parce que leur génotype ne sert pas au projet ou qu’elles ont dépassé douze mois, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de leur éviter les complications de santé liées à l’âge.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
L’information génétique transmise par les gamètes est compactée en fibre de chromatine dont l’unité de base se compose de protéines appelées histones. Les cellules reproductrices présentent la particularité́ d’utiliser des variantes d’histones qui ne sont pas trouvées dans les tissus somatiques et sont uniques à chaque espèce. Ces variantes sont parfois induites de manière aberrante dans des cancers humains. Que ce soit au cours de la reproduction ou dans un contexte pathologique, les fonctions de ces histones restent, à ce jour, peu connues. Ces histones se trouvant exclusivement sur le chromosome X des mammifères, l’étude de leurs fonctions in vivo nécessite une approche en modèles murins. Il existe des modèles de souris mutantes déficitaires pour ces histones et des travaux antérieurs ont montré que les mâles mutants présentaient une sous-fertilité et que 10 % des embryons succombaient in utero post-implantation. Ce projet, a pour but d’identifier les conséquences de la perte de ces histones sur la structure de la chromatine des cellules reproductrices ainsi que leurs rôles au cours du développement embryonnaire précoce. Enfin, il n’existe pas d’anticorps permettant de purifier ces histones dans leurs contextes natifs, et ce projet propose de produire de nouveaux modèles de souris permettant de les identifier in vivo. Dans son ensemble, ce projet permettra de comprendre de nouveaux mécanismes mis en jeu lors de la reproduction. L’identification des fonctions de ces variantes d’histones ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques aussi bien ciblant certains cancers que combattant des infertilités.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les modèles murins de ce projet ont pour but d’identifier de nouveaux processus contribuant à l’hérédité durant la reproduction. Ils présentent donc un bénéfice pour la compréhension fondamentale de ce processus. Les histones étudiées étant aussi présentes chez l’homme, ce projet contribuera à notre compréhension de la fertilité humaine. Enfin, ces variantes étaient induites de manière ectopique dans de nombreux cancers, leur caractérisation fonctionnelle ouvrira la voie vers de nouvelles routes thérapeutiques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un groupe d’animaux est soumis à deux injections intra-péritonéales durant chacune moins de 5 secondes et espacées de 48h afin de stimuler l’ovulation.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables sont : du stress et de l’angoisse de courte durée (moins de 2 minutes), et une douleur légère et transitoire, de quelques secondes, lors des injections intrapéritonéales. Bien qu’aucun phénotype dommageable n’ait été observé sur les lignées existantes, l’établissement des nouvelles lignées pourrait entrainer une baisse transitoire des performances reproductives chez les mâles.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Pour la collecte de tissus, les procédures s’effectuent post-mortem. Pour le maintien de la colonie, le sort prévu est l’euthanasie pour les génotypes non-utilisés ainsi que pour les animaux au-delà de 12 mois. Ceci permet de minimiser le stress dû à l’élevage et d’éviter les complications de santé pouvant apparaître avec l’âge. Les 120 femelles soumises à la sur-ovulation sont euthanasiées entre 12h et 4 jours suivant les injections.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’expression des gènes étudiés est limitée aux cellules reproductrices, y compris chez l’Homme. Actuellement, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire de remplacement. Les effets de ces gènes sont mesurables sur l’embryon avant l’implantation, le recours à un mammifère placentaire est donc nécessaire. La souris présente une bonne traçabilité génétique et il existe des approches génétiques déjà établies. Date de recherche de méthodes de remplacement sur base de données : 01/01/2024.
2. Réduction
La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1) Minimisation de l’élevage par des schémas de croisements qui permettent de générer une partie des animaux contrôles et tests dans la même portée. Les estimations du nombre de cages de croisement prennent aussi en compte une portée moyenne de 8 animaux tous les mois 2) La stratégie expérimentale de collecte de tissus post-mortem permet de prélever plusieurs tissus sur un même individu. Les estimations prennent aussi en compte le fait que plusieurs types de mesures (protéines, ARN, ADN…) peuvent être effectués sur 3 à 5 échantillons de tissus (testicules, épididymes, foie…), ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet.
3. Raffinement
La stratégie mise en œuvre pour réduire l’angoisse et la douleur induite est la suivante : 1) Utilisation du fond génétique qui présente peu de maladies spontanées et est bien adapté à l’élevage en laboratoire dans un contexte de recherche scientifique. Toutes les souris (maintenance et groupes expérimentaux) seront maintenues dans des cages avec milieu enrichi (matériel de nidification et tunnel de carton). Les lignées mutantes pour les histones étudiées présentent une légère diminution de fertilité, mais pas d’autres phénotypes dommageables à la survie et au confort des animaux en laboratoire. Ces animaux sont suivis de manière journalière. Les phénotypes des animaux produits dans ce projet n’ont pas encore été caractérisés et leur bien-être suivra une procédure d’évaluation accrue (grille d’évaluation sur deux générations) afin de déterminer s’ils présentent un phénotype dommageable. 2) Tous les tests s’effectuent post-mortem sur tissus, cellules ou embryons pré-implantatoires. 3) Afin de minimiser l’angoisse, l’ensemble de nos animaux sera surveillé chaque jour pour détecter tout signe de mal-être. Quatre indicateurs sont utilisés : – Posture et activité exploratoire dans la cage – Comportement naturel – Réponse à des stimuli extérieurs – Anomalie liée à la mise-bas chez les femelles gestantes. Tout individu présentant un signe de mal-être lors de ces surveillances fera l’objet d’une surveillance renforcée pendant 48h (voir point suivant). 4) La surveillance renforcée consiste en un suivi par grille d’évaluation du bien-être pendant 48h. Pour chacun de ces indicateurs, un score est déterminé par vérification visuelle et par manipulation. Un animal présentant un score entre 5 et 9 sera pesé. L’animal sera euthanasié si aucune amélioration du score n’est observée ou s’il présente une perte de poids supérieure à 20 % après 48h. Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale sera immédiatement euthanasiée.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix d’utiliser la souris répond aux critères de fertilité́ et de temps de génération requis pour une étude expérimentale en laboratoire. De plus, ces études nécessitent un modèle placentaire possédant tout le complément de gènes présents chez l’homme. Enfin, nous disposons d’outils génétiques chez la souris qui ne sont pas disponibles pour d’autres organismes modèles Pour les croisements ainsi que la collecte de tissus reproductifs matures post-mortem des animaux à maturité sexuelle sont utilisés – c’est à dire après leur sevrage et jusqu’à un an d’âge. Pour les études préimplantatoires, des stades de développement précédant et suivant l’activation du génome zygotique de 0,5 à 4,5 jours post-fécondation sont étudiés.