Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 22/06/2022
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-899689)
240 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules immunitaires humaines puis un vecteur de thérapie génique AAV, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la jugulaire pendant douze semaines, injections répétées de LPS, pompes implantées chirurgicalement sous le dos et anticorps injectés trois fois par semaine. Le porteur indique que les souris sont mises à mort par décapitation ou pentobarbital après un prélèvement terminal de sang et d’organes. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico ne rendent pas compte de la réponse immunitaire dans son ensemble et conclut que l’emploi d’un organisme vivant est « nécessaire ».
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s’explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Au laboratoire, nous avons récemment développé un modèle animal pour mimer la réponse préexistante anti-AAV. Ce modèle semble reproduire la réponse immune anti-AAV observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de souris humanisées, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire anti-AAV préexistante et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser l’interleukine 34 (IL-34) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires impliqués naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. Dans la seconde stratégie, un anticorps anti- CD45RC sera utilisé pour moduler l’action des cellules exprimant fortement le marqueur CD45RC. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune préexistante dirigée contre le vecteur de thérapie génique.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Un prélèvement sanguin par semaine sera réalisé pendant 12 semaines. Les animaux seront anesthésiés et le sang sera prélevé au niveau de la jugulaire. La durée totale d’intervention est estimée à environ 3 mn. Chaque animal sera injecté 2 fois en intraveineuse dans la veine caudale sous anesthésie gazeuse. L’une pour l’injection d’AAVr à J 0, l’autre pour les cellules immunitaires humaines à J+1. La durée totale d’intervention est d’environ 5 mn. Les animaux recevront 3 injections en intra-péritonéale de LPS à J+1, J+2, J+3 après l’injection IV du vecteur. Une injection en IP se fait en moins d’une minute. Des injections IP d’IL-15 seront réalisées 2 fois par semaine pendant les 12 semaines de suivi du projet. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation. 48h avant injection de l’AAVr, des pompes Alzet rechargeables-iPrecio seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des souris permettant de diffuser de l’IL-34 sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge en IL-34, s’effectuera tous les 15 jours après palpation de l’orifice de la pompe rechargeable à travers la peau. La recharge s’effectue en moins de deux minute. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation B, l’anticorps anti-CD45RC ou l’anticorps contrôle seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. Compte tenu de la fréquence, les animaux ne seront pas anesthésiés. Les souris seront placées dans un tunnel de contention pendant 2 minutes le temps de l’injection. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés en gazeuse.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique notable. L’utilisation de seringue à insuline équipée d’une petite aiguille de 30 G permet de limiter le désagrément de la piqûre. L’installation d’une pompe rechargeable-iPrecio nécessite une petite chirurgie pour la placer en sous-cutanée. L’animal sera sous analgésie en pré et post opératoire pendant 24h. Au-delà, aucune douleur n’est attendue.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Tous les animaux seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (entre 1 et 3 mois maximum post-injection selon les réponses aux stratégies d’immunomodulations), jour de l’euthanasie et de la réalisation des prélèvements de tissus et d’organes. En ce qui concerne les animaux des différents groupes expérimentaux, notre protocole requiert un prélèvement terminal d’une grande quantité de sang sur lequel s’appuiera certaines analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques, mais également pour éliminer la plus grande majorité de sang des organes ou tissus tels que le foie, le cœur, la rate, les poumons, le cerveau, les reins ou encore les muscles squelettiques qui seront prélevés pour analyses. Les animaux subiront donc une anesthésie gazeuse préalable (isoflurane : induction 5%) suivie d’une décapitation qui sera systématiquement réalisée par du personnel compétent pratiquant cette technique en routine. Tous les animaux sont concernés par cette procédure exceptés les animaux inclus qui entrent dans le cadre de la procédure de perfusion du foie pour isolement des cellules. Dans le présent cas, le sang ne sera pas récupéré après perfusion hépatique, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane et mis à mort par injection de pentobarbital (Euthasol vet à la dose de 140 mg/kg en IV ou IC).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’utilisation de méthodes alternatives tels que des techniques in vitro ou in silico ne permettent pas de rendre compte de la réponse immunitaire dans son ensemble, l’emploi d’un organisme vivant est donc nécessaire. La souris est un modèle de choix par sa petite taille, ses performances de reproduction et sa durée de vie. Jusqu’à présent aucun modèle animal n’a pu prédire une réponse immune préexistante contre le vecteur AAV car la plupart ne sont pas des hôtes naturels de l’AAV. Néanmoins, dans plusieurs essais cliniques cette réponse a été mise en évidence et a conduit à la perte de l’efficacité du traitement. Le récent développement d’un modèle de souris humanisées nous a permis de reproduire cette immunité préexistante en laboratoire. Ce modèle animal pourra nous permettre de développer des stratégies pour moduler la réponse immune et permettre le maintien de l’expression du gène thérapeutique à long terme.
2. Réduction
Chez l’humain, l’intensité de la réponse immune est variable, ainsi pour que les résultats soient statistiquement interprétables nous envisageons au maximum d’injecter les cellules de 10 donneurs humains. Au maximum, 240 animaux seront utilisés dans le projet. Si la variabilité de réponse est faible entre les donneurs et donc que les résultats sont statistiquement interprétables avant d’atteindre les 10 donneurs, le protocole sera arrêté pour ne pas mettre à mort des animaux supplémentaires. Ce nombre a été calculé statistiquement et permet de réduire le nombre d’animaux au maximum tout en obtenant des résultats probants.
3. Raffinement
Le souci du bien-être animal passera par : (i) De bonnes conditions d’hébergements. Par exemple pour les cages comportant plus de 2 souris, une bonne quantité de frisottis en carton est ajouté dans chaque cage pour enrichir l’environnement des animaux. Pour les cages comportant moins de 3 animaux, en plus des frisottis, est ajouté un igloo en cellulose. Des petits morceaux de bois à ronger sont distribués. Les litières sont changées 2 fois par semaine. Un suivi régulier des animaux, chaque cage est inspectée quotidiennement pour vérifier que les animaux se portent bien ainsi que pour contrôler le niveau de nourriture et d’eau. (ii)L’instauration de points limites pertinents et précoces. La détermination des points limites se basera sur la grille d’évaluation ci-dessous, adaptée aux procédures envisagées. En cas de 3 signes cliniques notables ou 1 signe clinique sévère, l’euthanasie sera décidée. -Signes cliniques notables : lésion sans effraction cutanée, agitation, hypomobilité, hyperréactivité, résistance à la manipulation, stéréotypie, poil piqué, gonflement abdominal, perte de 10% à 20% du poids, diminution ou absence de prise de nourriture/d’eau… -Signes cliniques sévères : lésion sévère, saignement incontrôlable, akinésie, convulsions, respiration difficile ou suffocation, absence de fèces ou fèces liquides, déshydratation, perte >20% du poids, douleur à la palpation… (iii)La mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie ou mise à mort par des méthodes reconnues).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans la majorité des études de thérapie génique ou d’immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L’utilisation de la souris est justifiée à la fois par l’existence de plusieurs modèles murins humanisés ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Le modèle murin (NOD/SCID/HLA-A2) est couramment utilisé en transfert adoptif de cellules humaines, car il permet une bonne survie des cellules transférées. L’expression de l’allèle du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I HLA-A2.1 est indispensable car les cellules humaines transférées ont un répertoire restreint à cet allèle. La preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV préexistante étant faite chez la souris NSG HLA A2, le développement de stratégies d’immunomodulation dans ce modèle est privilégié. Les souris seront injectées entre 6 et 14 semaines d’âge. À ce stade, les tissus de soutien et les niches nécessaires au support et à la survie de transfert adoptif de cellules sont suffisamment développés pour permettre le succès du transfert adoptif.